靈芝調節免疫細胞功能的作用機制及研究進展

謝文琦，韓雯，付璐，肖盛元，張林波，

（1.吉林農業大學生命科學學院，吉林 長春 130118；2.吉林農業大學食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長春 130118）

靈芝（Ganoderma lucidum）為擔子菌亞門，層菌綱，多孔菌科，靈芝屬真菌，作為菌物藥原料的使用和研究已經有悠久的歷史[1]。靈芝的活性成分有多糖類、三萜類[2]、蛋白質[3]、甾醇類[4]、核苷類[5]、微量元素[6]等，具有廣泛的藥理作用[7]。一般認為，靈芝多糖和三萜類化合物對免疫系統功能有調節作用，目前人們已經從靈芝中分離出21種靈芝多糖和83種靈芝三萜類化合物[8-9]。靈芝因其具有顯著的免疫調節活性而被廣泛用于保健品、免疫調節劑或癌癥治療的輔助劑。

免疫是一個復雜的生理過程，生物體的免疫系統能夠識別病原體和自身突變細胞，并對目標進行殺傷和清除來實現免疫應答過程[10]。在免疫應答過程中，免疫細胞是免疫系統的重要組成部分，免疫細胞的活性和數量代表免疫能力的強度[11]。但目前靈芝對免疫細胞的調節作用相關分子機制尚不清楚，因此對其進行深入研究將會進一步揭示靈芝活性成分免疫調節功能的機理，對靈芝產品進一步開發和使用提供參考。

1 靈芝對固有免疫細胞的影響

固有免疫是機體與生俱來的能力，也是一切免疫應答的基礎，機體可通過固有免疫對病原體和異物進行處理。其中參與固有免疫的細胞主要是自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）、巨噬細胞和中性粒細胞。研究發現，來自靈芝的活性物質（如多糖和三萜類化合物）可以通過增加NK細胞受體的數量和殺傷能力，增強巨噬細胞的吞噬功能，調節細胞因子的分泌，實現固有免疫調節作用。

1.1 對NK細胞的調節及其機制

靈芝能夠增強NK細胞對病原體和病變細胞的識別、提高NK細胞的殺傷能力、促進NK細胞的增殖和發育成熟。Chang等[12]使用靈芝菌絲體水提物處理人NK細胞系（NK92細胞），結果顯示，水提物的處理能夠增加NK細胞受體（natural cytotoxic receptor，NCR）/自然殺傷細胞2族成員D（natural killer group 2 member D，NKG2D）的表達，增加NK細胞內絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPKs）的磷酸化，使其大量分泌穿孔素和顆粒溶素，增加其對多種腫瘤細胞的殺傷能力。該結果表明，靈芝具有調節NK細胞功能的作用，并揭示了該過程的分子機制。Yang等[13]構建了NK92細胞與胃癌細胞株共培養的腫瘤細胞殺傷模型，并利用靈芝多糖（Ganoderma lucidum polysaccharide，GLP）對該模型進行刺激。結果表明，靈芝多糖（GLP）能夠激活NK細胞對腫瘤細胞的殺傷能力。此外，GLP還可通過激活NKG2D及其下游DNA X激活蛋白 10（DNA X activation protein 10，DAP10）/磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）/胞外信號調節蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信號通路提高NK92細胞本身的活性。Lai等[14]對小鼠注射靈芝多糖F3，結果顯示，F3使小鼠脾臟中NK細胞和NKT細胞的數量大量增加，表明靈芝多糖F3能夠促進NK及NKT細胞的增殖。Wu等[15]用靈芝β葡聚糖處理健康小鼠，觀察NK細胞介導的細胞毒性變化，結果表明，NK細胞毒性水平顯著增加，并且該變化是持續的。

1.2 對中性粒細胞的調節及其機制

靈芝活性成分能夠調節中性粒細胞的數量，從而維持機體實現免疫穩態，調節免疫系統功能。長期高負荷運動會降低機體中性粒細胞的數量，從而影響機體免疫功能。Shi等[16]研究發現，靈芝多糖（GLP）能夠調節長期高負荷運動小鼠的免疫功能。實驗利用GLP對長期高負荷運動小鼠模型進行灌胃，4周后檢測中性粒細胞（neutrophil granulocyte，NEUT）數量。結果顯示，相比于對照組，中、高劑量GLP灌胃治療均能顯著增加模型小鼠體內的絕對中性粒細胞數。Lei等[17]從靈芝子實體中分離得到了免疫調節蛋白真菌蛋白靈芝8（LZ-8），并研究了其對中性粒細胞減少癥的影響。試驗利用LZ-8對環磷酰胺誘導的中性粒細胞減少小鼠模型進行了治療，結果表明，LZ-8能夠促進骨髓造血干細胞（hematopoietic stem cell，HSC）分化和募集，提高中性粒細胞的分泌水平。此外，Zhou等[18]研究了重組靈芝免疫調節蛋白8（recombinant Lingzhi 8，rLZ-8）對免疫系統的調節功能。結果顯示，rLZ-8的處理能夠增加免疫功能障礙和免疫系統失衡小鼠體內的中性粒細胞數量。周慧[19]的研究也表明，rLZ-8能夠增加體內中性粒細胞及其他免疫細胞的數量，治療小鼠白細胞減少癥，改善免疫功能損害和免疫系統失衡。

1.3 對巨噬細胞的調節及其機制

靈芝活性成分能夠提高巨噬細胞的活性及吞噬能力，還能夠刺激巨噬細胞產生細胞因子介導其他免疫過程。Yeh等[20]在對靈芝多糖（polysaccharides from ganoderma atrum，PS-G）的免疫系統功能調節作用過程中發現，PS-G激活固有免疫是通過對巨噬細胞的激活實現的。孫美芳等[21]、任瑋等[22]研究了靈芝孢子粉對免疫系統調節作用。研究利用環磷酰胺和糖皮質激素構建小鼠的免疫抑制模型，該模型具有巨噬細胞活性下降，吞噬能力降低的特點。靈芝孢子粉能使模型小鼠巨噬細胞的活性和吞噬功能顯著提高。Li等[23]使用靈芝多糖GLP對乳腺癌小鼠進行治療，結果表明，GLP可能是通過激活巨噬細胞MAPK/c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）/p38/ERK，以及核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）等信號通路實現抑制腫瘤細胞的增殖和遷移，激活小鼠巨噬細胞、增強巨噬細胞吞噬功能的效應。表明靈芝活性成分對巨噬細胞功能的增強可能是由于相關受體介導。Li等[24]為研究靈芝多糖（PSG-1）對巨噬細胞免疫反應的影響，使用PSG-1處理LPS刺激的巨噬細胞炎癥模型，結果顯示，甘露糖受體（mannose receptor，MR）和 Toll樣受體 4（toll-like receptor 4，TLR4）通過 NF-κB 通路在受 PSG-1作用的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激的巨噬細胞中協調TLR4介導的信號級聯反應。這說明NF-κB通路在協調MR和TLR4以引發對PSG-1的免疫反應方面起著核心作用。

靈芝活性成分對巨噬細胞的影響是多樣的，不僅對巨噬細胞本身的吞噬能力及發育有顯著影響，還能夠對巨噬細胞的細胞因子分泌水平進行調節。Yu等[25]分離獲得了靈芝多糖（PSG-1），探究其對小鼠巨噬細胞系RAW264.7的免疫調節作用。結果顯示，靈芝多糖（PSG-1）能夠劑量依賴性地誘導巨噬細胞釋放腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細胞介素-1β（interleukin-1 β，IL-1β），增強巨噬細胞吞噬功能，該效應可能是通過激活NF-κB通路實現的。此外，該靈芝多糖通過降低TNF-α、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β等促炎細胞因子和環氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、活性氧 （reactive oxygen species，ROS）等炎癥介質的表達實現對巨噬細胞的調控作用[26]。Tsai等[27]發現使用Smith降解法獲得的靈芝多糖酸水解片段肽聚糖（GLPS-SF1）可通過Toll樣受體4（TLR4）信號途徑提高巨噬細胞細胞因子分泌水平。Hu等[28]研究使用靈芝乙醇提取物對LPS刺激的小鼠巨噬細胞系Ana-1細胞炎癥模型進行處理，結果顯示該提取物能夠顯著抑制Ana-1細胞分泌IL-1β、IL-6、TNF-α、前列腺素 E2（prostaglandin E2，PGE2）等細胞因子，具有顯著抗炎活性。Huang等[29]使用靈芝多糖（GLP）和豬苓多糖（polyporus umbellatus polysaccharide，PUP）的多糖組合物（composition of ganoderma lu cidum polysaccharides and polyporus umbellatus polysaccharides，GPP）對小鼠口服給藥，結果顯示GPP能夠提高巨噬細胞一氧化氮（nitric oxide，NO）的產生以及誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和腫瘤壞死因子（TNF-α）的mRNA表達，顯著提高巨噬細胞的吞噬功能和NK細胞的活性。

2 靈芝對適應性免疫細胞的影響

適應性免疫是機體自身通過抵抗外源性異物獲得的能力，與適應性免疫相關的細胞主要包括B淋巴細胞、T淋巴細胞、抗原呈遞細胞等。因此適應性免疫能力的增強是提高自身免疫能力的一個重要途徑。靈芝調節適應性免疫主要從以下兩方面進行：一是提高免疫細胞自身活性，促進增殖分化和成熟[30]，以此實現對免疫細胞的直接影響；二是對免疫細胞所分泌的細胞因子水平進行調節，以此來達到間接調控作用。

2.1 對T細胞的調節及其機制

Su等[31]在靈芝孢子破壁多糖通過腸道菌群調節適應性免疫功能的研究中發現，靈芝孢子破壁多糖CPGS（crude polysaccharides of G.lucidum spores，CPGS）和 RPGS（refined polysaccharides of G.lucidum spores，RPGS）均能增加胸腺中未成熟T細胞的比例，而只有RPGS可顯著提高外周血T細胞數量并促進T細胞分化和活化。Liu等[32]發現重組靈芝蛋白8（rLZ-8）能夠通過抑制肺部炎癥反應，減少炎癥細胞的浸潤，從而有效緩解卵清蛋白（ovalbumin，OVA）誘導的哮喘模型小鼠的癥狀。在其體外試驗中，rLZ-8能夠通過抑制T細胞中信號傳導及轉錄激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT3）和 NF-κB 的信號通路（P100/P52）抑制T細胞浸潤，并且能夠通過調節輔助性 T 細胞 17（T helper cell 17，Th17）/調節性 T 細胞（regulatory cell，Treg）在體內的平衡來減輕肺部炎癥反應。Henao等[33]在臨床研究中發現口服衍生自靈芝的β-葡聚糖能夠提高免疫低下幼齡兒童的免疫應答能力，該能力的提升通過外周血中CD3+、CD4+和CD8+T細胞數量以及固有免疫細胞的激活實現。黏膜免疫是執行局部特異性免疫功能的主要場所，Lin等[34]使用靈芝多糖（PS-G）作為腸道病毒EV-A71黏膜疫苗的佐劑并研究其作用。結果表明，當EV-A71疫苗含有PS-G時，脾細胞中的T細胞增殖反應和干擾素γ（interferon gamma，IFN-γ）、白細胞介素 17（interleukin 17，IL17）分泌水平顯著增加，因此PS-G有可能用作EVA71黏膜疫苗的佐劑。靈芝活性成分所發揮的抗腫瘤效果越來越被重視，而與T細胞相關的免疫應答調節機制也逐漸被發現。Su等[35]通過對4T1乳腺癌異種移植小鼠模型給藥靈芝破壁孢子提取物（sporodermbreaking spore of Ganoderma lucidum，ESG）來研究其抗癌潛力。結果表明，ESG能夠在體內抑制4T1腫瘤生長，并顯著增加荷瘤小鼠外周血中細胞毒性T細胞（cytotoxic T cells，Tc）的數量和Tc與輔助性T細胞（T helper cell，Th）的比率。此外，ESG明顯下調脾臟中程序性細胞死亡蛋白 1（programmed death-1，PD-1）和腫瘤中細胞毒性T淋巴細胞抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4，CTLA-4）這兩個免疫檢查點，這項研究表明，ESG將通過恢復耗盡的Tc發揮其抗腫瘤活性。Wang等[36]的研究表明，靈芝多糖（GL-PS）可以顯著促進荷瘤大鼠脾臟T淋巴細胞增殖，表明GL-PS可以增強細胞免疫和改善免疫系統。此外GLPS增加血清IL-2、TNF-α和IFN-γ的濃度，增強自然殺傷細胞和T細胞的細胞毒性，促進樹突狀細胞功能成熟，從而抑制膠質瘤生長并延長大鼠的存活期。Fan等[37]發現冬蟲夏草和靈芝聯合真菌多糖（fungal polysaccharides from cordyceps sinensis and ganoderma atrum，CFP）使環磷酰胺（cyclophosphamide，CP）誘導的結腸免疫功能障礙小鼠細胞因子分泌和Treg/Th17趨于平衡狀態，以及下調TLR介導的炎癥信號通路并促進分泌性免疫球蛋白A（secretoryimmunoglob-ulin A，sIgA）分泌以抑制結腸炎癥。

2.2 對B細胞的調節及其機制

靈芝能夠激活B細胞、刺激B細胞的增殖和分化，提高B淋巴細胞的分泌水平。Zhang等[38]利用靈芝多糖GLP對荷肉瘤S180小鼠進行治療，結果顯示，靈芝多糖GLP可以直接刺激B細胞中蛋白激酶Cα（protein kinase Cα，PKCα）和蛋白激酶 Cγ（protein kinase Cγ，PKCγ）的表達，激活B細胞，促進其增殖和分化，誘導小鼠產生大量免疫球蛋白調節免疫功能。宋志強等[39]通過體外實驗探究黃邊靈芝多糖的生物活性，以及其對B淋巴細胞增殖的影響。結果顯示，當黃邊靈芝多糖濃度為10 μg/mL時，能夠顯著刺激B淋巴細胞增殖。Wang等[40]發現使用靈芝三萜GLE處理人B淋巴細胞GM00130，能夠使B淋巴細胞中趨化因子5（C-C motif chemokine ligand 5，CCL5）的表達量增加，B淋巴細胞中程序性細胞死亡蛋白1（PD-1）的比例明顯降低，因此減少PD-1蛋白的表達可能是靈芝介導的免疫調節的一個重要機制。

2.3 對樹突細胞的調節及其機制

樹突細胞（dendritic cell，DC）的主要職責是抗原遞呈，并具有活化T細胞、分泌細胞因子的功能，對其他免疫細胞功能的調節以及免疫反應的產生有著重要作用[41]。而靈芝及其活性成分對DC細胞的調節作用主要是促進細胞成熟和增殖，以及提高細胞因子的分泌水平。

Yoshida等[42]研究了靈芝提取物以及其中的β-葡聚糖對DC細胞功能的影響。結果表明這些活性成分能夠激活DC，并產生大量IL-23，在體內外均可誘導Th17分化，口服靈芝可提高Th17細胞百分率和抗菌肽轉錄水平。Chan等[43]使用靈芝多糖GL-PS處理體外培養的白細胞單核細胞系THP-1和U937細胞，結果顯示，THP-1和U937細胞均有增殖反應，其中THP-1能夠轉化為典型的DC形態，且轉化后的THP-1樹突狀細胞與正常單核細胞來源的DC具有相似的抗原攝取能力。Ding等[44]研究了黑靈芝多糖（PSG-1）在腸上皮細胞與其內部免疫細胞相互作用中的作用，利用PSG-1對類腸樣Caco-2/DC細胞共培養模型進行研究。結果顯示，PSG-1能夠通過NF-κB和MAPK途徑間接影響DC的免疫功能，說明該靈芝多糖能夠促進DC成熟，調節腸道DC的免疫反應，是維持腸道穩態、提高機體免疫力的關鍵。Lin等[45]用PS-G處理DC導致 CD80、CD86、CD83、CD40、CD54 和人類白細胞抗原（human leukocyte antigen DR，HLA-DR）在細胞表面表達增強，以及白細胞介素 12（interleukin-12，IL-12）、白細胞介素10（interleukin-10，IL-10）表達增強，DC細胞吞噬能力受到抑制。進一步研究表明，PS-G能夠增強 κB 激酶抑制劑（inhibitor of kappa B kinase，IκB）和NF-κB的活性以及IκBα和p38MAPK磷酸化。為提高靈芝純化活性成分的免疫調節功能和天然中草藥多糖對癌癥治療的可靠性，Zhang等[46]使用含有金納米復合材料的靈芝多糖（GLP-Au）誘導DC活化，結果顯示 CD80、D86、CD40、主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex class II，MHCII）增加、吞噬能力和酸性磷酸酶活性降低以及細胞因子轉錄增加。與GLP相比，體外GLP-Au能夠誘導更強的DC激活以及強大的T細胞反應（CD4/CD8+T細胞增殖）。因此多糖納米制劑能夠提高免疫活性多糖的穩定性和延長活化時間，對將納米技術應用于傳統醫學的現代化有重大意義。靈芝及其活性成分對免疫細胞的影響見圖1。

圖1 靈芝活性成分對免疫細胞的影響Fig.1 Effect of Ganoderma lucidum active ingredient on immunocytes

3 結論與展望

靈芝具有廣泛的生物學功能，而其免疫調節活性更是人們研究的熱點。靈芝及其活性成分能夠通過調節多種免疫細胞如T淋巴細胞、B淋巴細胞、NK細胞，巨噬細胞、DC細胞等來實現免疫系統調節的功能，在機體抵御抗原入侵、維持免疫系統穩態過程發揮重要作用。目前，大多數研究對靈芝的有效成分單體進行分離提純，并探討了其生物學功能，而其具體的作用機制還有待于進一步明確。此外，靈芝整體作為藥用真菌，它有效成分的作用以及作用對象都不是獨立的，對免疫功能的影響更是全面、系統而復雜的，因此靈芝有效成分之間的相互作用，以及其對免疫系統的整體影響、作用機制還有待于更深層次的研究。