水稻葉綠素含量主效QTL定位

姚曉云，楊 平，黃永萍，彭志勤，劉 進，吳延壽，鄒國興，尹建華

（江西省農業科學院 水稻研究所/水稻國家工程研究中心（南昌）/國家水稻改良中心 南昌分中心/中菲水稻技術聯合實驗室，江西 南昌 330200）

葉綠素是植物吸收、傳遞、轉換光能的關鍵色素，葉綠素含量與功能對作物產量和品質的形成具有重要影響［1-3］。近年來，諸多研究表明葉綠素含量及其動態變化規律對水稻的產量和品質形成存在明顯的影響及調控作用［4-5］。Jiang等［6］研究表明，較低的葉綠素含量導致光合作用減弱，結實率降低，籽粒充實度下降，進而顯著影響稻谷產量；水稻品種葉綠素含量（SPAD值）隨生育進程的推進呈現逐漸降低的趨勢，分蘗期葉綠素含量與產量呈顯著正相關關系。王志東等［7］研究表明，秈稻黃熟期和蠟熟期劍葉SPAD值與稻米食味值、蛋白質含量存在明顯的相關性，其中黃熟期SPAD值對品質的影響更為顯著，劍葉SPAD值越高，稻米蛋白質含量越低，食味品質越好。成熟期葉綠素含量降低稱為葉綠素降解或衰老，一般發生在植株自然發育末期；葉綠素降解發生的時期對于植株最終產量和品質具有重要影響［8］。

水稻葉綠素含量是典型的數量性狀，受多個QTL調控且存在明顯的環境效應［9-10］。近年來，有關水稻葉綠素含量的研究較多，已有650個相關的QTL被鑒定報道，但僅有 qLSCHL4、qFCC7L、qSPAD4和qCTH4等少數幾個主效QTL被精細定位或克隆，已定位的位點主要為孕穗~抽穗期葉綠素QTL；而有關不同生育時期葉綠素含量動態變化及降解指數QTL定位的研究相對較少［11-13］。鑒于此，本研究以屜錦和北陸129雜交-回交衍生的BIL和CSSL群體為試驗材料，對不同生育時期葉片葉綠素含量和降解指數進行了QTL剖析，旨在發掘與葉綠素含量和降解指數相關的主效QTL，解析不同生育時期葉綠素含量的變化規律，為水稻葉綠素含量“階段性”分子遺傳調控研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與田間試驗

以屜錦和北陸129雜交-回交衍生的BIL和CSSL群體為試驗材料，遺傳群體均由日本農業生物資源研究所Yano博士研究團隊提供。試驗于2021年在江西省農業科學院水稻研究所南昌試驗基地進行，于5月18日播種，濕潤水育苗；在6月15日移栽，行株距為20 cm×16.5 cm，每穴1苗；其他田間管理與當地生產田相同。

1.2 性狀測定

在分蘗期、抽穗期和灌漿成熟期選取中間行區的5個單株，利用葉綠素儀（SPAD-502 plus） 測定BIL和CSSL群體各株系的SPAD值，每株系選取5個單株主莖頂部葉片（劍葉），分別測定葉片上、中和下3個區域的SPAD值，共獲取15個數值，利用SPAD指標評價各株系葉綠素含量，2次生物學重復，取均值統計分析。

1.3 遺傳圖譜構建與QTL分析

BIL群體自2009年引入，經多年田間種植后部分株系存在分離和變異，且原遺傳圖譜采用RFLP標記構建，遺傳距離、標記密度與新的SSR和Indel標記存在明顯差異。本研究利用新合成的SSR和Indel標記重新構建分子遺傳圖譜；新遺傳圖譜包括205個分子標記，覆蓋基因組1561.2 cM，標記間的平均距離為7.58 cM，染色體平均標記數為17.08個；CSSL群體的遺傳圖譜參考Ando等［14］公布的數據。

采用CTAB法提取水稻基因組DNA，PCR擴增體積為10 μL，包括DNA模板1.5 μL、引物（10 μmol/L）各1.25 μL、5.0 μL的2×Es Taq Master PCR混合體系、1.0 μL ddH2O。PCR擴增程序為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 35 s，55~58 ℃ 35 s，72 ℃ 35 s，32個循環；72 ℃ 7 min，10 ℃保存備用。PCR擴增產物采用4%~5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。采用QTL ICI Mapping v4.2軟件的完備區間作圖（ICIM）方法［15］進行QTL檢測分析，LOD閾值設為2.50，當標記區域LOD值≥2.50時，就判定該區段存在1個QTL，同時估算每個QTL的加性效應值和貢獻率大小。QTL的命名遵循McCouch等［16］的原則。利用CSSL群體進行QTL驗證分析，發掘和驗證調控葉綠素含量的主效QTL，并將染色體片段代換系與受體親本進行比較和差異顯著性分析，鑒定相關主效QTL。

2 結果與分析

2.1 表型分析

親本在抽穗期和不同生育時期的葉綠素含量存在顯著差異，呈現動態變化特征；高產秈稻北陸129在不同生育時期的葉綠素含量明顯高于優質粳稻屜錦，且其降解指數較小，具有較好的持綠特性。BIL群體各株系的抽穗期、葉綠素含量和降解指數存在較大變幅，存在超親分布現象，峰度和偏度值接近于1.00，表現為正態連續分布，這表明抽穗期、葉綠素含量和降解指數屬于多基因控制的數量性狀，符合QTL作圖要求（表1、圖1）。

相關分析表明：抽穗期僅與降解指數存在極顯著相關性，與各生育時期葉綠素含量未達到顯著相關性；抽穗期葉綠素含量與分蘗期、成熟期葉綠素含量存在極顯著相關；分蘗期葉綠素含量與成熟期葉綠素含量未達到顯著相關性；葉綠素降解指數與抽穗期和成熟期葉綠素含量的相關性達到極顯著水平，與分蘗期葉綠素含量的相關性不顯著（表2）。

2.2 QTL分析

BIL群體共檢測到17個與葉綠素含量相關的QTL，分布于第1~5、7、9和11號染色體上（表3、圖2），單一QTL解釋13.99%~27.04%的表型變異。檢測到4個調控抽穗期的QTL，分別位于第1、7、11和12號染色體上，其中qHD7和qHD12的貢獻率和加性效應值較大，是2個主效調控抽穗期的位點；在分蘗期檢測到4個與葉綠素含量相關的QTL（qCHT2、qCHT4、qCT9和qCT12），其中qCHT2的LOD值和貢獻率最大，分別為13.25%和25.79%；qCHT4和qCHT9的加性效應值較大，分別為2.66和-2.72，前者增效等位基因來自北陸129；檢測到影響抽穗期葉綠素含量的QTL 4個，分別位于第2、4、5和9號染色體上，其中qCHH2和qCHH5的貢獻率和效應值較大；在成熟期檢測到5個與葉綠素含量相關的QTL，分別為qCHM1、qCHM3、qCHM4、qCHM5和qCHM12，其中qCHM3和qCHM4的貢獻率和效應值較大，且有益增效等位基因均來自北陸129；檢測到3個與葉綠素降解相關的QTL（qCD3、qCD4和qCD9），其 中qCD4的 貢 獻 率和效應值較大，可以延緩葉綠素降解（圖2）。

表1 親本和BIL群體在不同生育時期葉綠素含量的表型分析

圖1 親本和BIL群體在不同生育時期葉綠素含量的表型分析

表2 不同生育時期葉綠素含量相關分析

圖2 水稻不同生育時期葉綠素含量QTL染色體分布

2.3 CSSL驗證分析

以受體親本屜錦為對照，將染色體片段代換系的抽穗期葉綠素含量、成熟期葉綠素含量和降解指數逐一與對照進行差異分析，結合染色體片段局部代換分析鑒定相關QTL。研究共發現葉綠素含量和降解指數存在顯著差異的株系8個，包括SL02、SL09、SL14、SL25、SL28、SL32、SL33和SL39（圖3），鑒定出7個與葉綠素含量相關的QTL簇，分別為qSPAD1、qSPAD3、qSPAD4、qSPAD7、qSPAD9、qSPAD10和qSPAD12（表4）。有4個QTL簇與BIL群體存在共表達，即qSPAD1與qCHM1，qSPAD3與qCHM3、qCD3，qSPAD4與qCHH4、qCHM4，qSPAD9與qCHT9、qCHH9所在染色體區域相近；與以往研究比較發現，這些位點具有較好的重演性。同時，我們還發現了一個新的主效QTL qSPAD12。

3 討論與結論

葉綠素是水稻植株進行光合作用的物質載體，改良植株的光合性能、提高葉綠素含量是增強光合速率和提高水稻產量潛力的關鍵所在［17-19］。水稻全生育期葉綠素合成與降解是一個動態過程，不同生育時期葉綠素含量存在動態變化，這種動態變化對穗部產量和品質性狀具有顯著影響，尤以抽穗~成熟期影響效應最為顯著。在生育前期葉綠素為營養器官形成提供物質基礎；在孕穗~抽穗期葉綠素為鞏固枝梗、積累灌漿儲備物質和提高結實率奠定基礎；在灌漿成熟期葉綠素為籽粒結實、灌漿和粒重形成提供關鍵物質來源［9，20-21］。本研究表明，不同生育時期葉綠素含量存在明顯的動態變化，各時期葉綠素含量存在一定相關性，抽穗期葉綠素含量與分蘗期、灌漿期葉綠素含量及降解指數存在極顯著相關性。研究還發現，分蘗期親本和BIL群體的葉綠素含量較高，植株葉綠素代謝以合成為主；抽穗后葉綠素含量逐漸降低；灌漿成熟期多數株系的葉綠素含量顯著降低，葉綠素代謝以降解反應為主。此外，研究也表明，抽穗時期早晚對葉綠素含量和降解指數有明顯影響，抽穗期與降解指數呈現極顯著正相關。這表明，水稻生長發育進程中葉綠素含量依據源供給和庫需求表現出明顯的動態變化，植株生產潛力受葉綠素含量、動態變化和生育期等多因素的共同影響，選育葉綠素含量適宜和源庫流協調的水稻新品種是實現高產優質的途徑之一。

表3 不同生育時期葉綠素含量相關QTL分析

表4 利用CSSL群體鑒定葉綠素含量相關QTL

調控不同生育時期葉綠素含量的QTL不盡相同，控制不同發育階段葉綠素含量的遺傳基礎存在明顯差異，葉綠素代謝基因存在時空表達現象［11，22-23］。阿加拉鐵等［20］對灌漿結實期不同階段葉綠素含量進行QTL分析，共檢測到7個與葉綠素相關的QTL，調控葉綠素含量的QTL存在時空表達特性，多數QTL僅參與調控某一階段的葉綠素含量，少數幾個QTL在整個時期持續表達；李永洪等［24］利用RIL群體對分蘗期和抽穗期葉綠素含量進行QTL定位，在兩年環境下共檢測到30個QTL，單個QTL的表型貢獻率為5.91%~38.69%，其中8個位點在不同年份環境下共性表達。本研究利用BIL群體對不同生育時期葉綠素含量進行QTL分析，共檢測到13個與葉綠素含量相關的QTL，這些QTL大致可分為3類：第一類為調控某一時期葉綠素含量的QTL，包括qCHM1、qCHM3和qCHM4；第二類為調控多個生育時期葉綠素含量的QTL，包 括qCHL2（qCHT2、qCHH2）、qCHL4（qCHT4、qCHH4）、qCHL5（qCHH5、qCHM5）和qCHL9（qCHT9和qCHH9）；第三類為調控葉綠素降解的QTL，包括qCD3、qCD4和qCD9，其中降解指數QTL qCD3與qCHM3、qCD4與qCHM4位于相同染色體區域，這表明葉綠素降解與定位區域內QTL階段性表達有關。

利用CSSL群體初步鑒定了7個影響葉綠素含量的染色體區段，其中qSPAD1、qSPAD3、qSPAD4和qSPAD12分別與BIL群體檢測到的主效QTL簇qCHL1、qCHL3、qCHL4和qCHL12所在染色體區域相近，這些位點在不同群體中共性表達，且表型貢獻率較大，可能是決定葉綠素含量的關鍵QTL。與前人定位結果標記進行對比分析，發現qSPAD1與GN1a區域相近，可能是GN1a基因的多效性；qCHL3與姜樹坤等［11］鑒定的葉綠素代謝關鍵區域qCHH3相近；qCHL4所在區域為調控水稻葉綠素含量的熱點區域，該區域已有qSPAD4［25］、qCTH4和qNAL1［26］等主效QTL被精細定位，這些產量相關基因在水稻品種改良中被有意識利用，優異單倍型在育成品種中廣泛存在。qCHL12/qSPAD12是本研究新發現的一個調控葉綠素含量的主效QTL，該QTL區域具有影響抽穗期和調控不同生育期葉綠素含量的功能，且其LOD值、表型貢獻率和效應值均較大，其相關染色體區域的功能和調控機理仍需進一步研究確定。