富含絲氨酸和精氨酸的剪接因子1、轉錄因子7類似物2在胃癌組織中的表達及與化療藥物耐藥性的關系△

梁倩萍，褚菲菲

鄭州大學附屬鄭州中心醫院消化內科，鄭州 450000

胃癌是臨床常見的惡性腫瘤，其發病率和病死率均較高，由于胃癌早期無明顯特異性癥狀，部分患者就診時已處于胃癌晚期，錯過了最佳的手術時間，因此對于晚期胃癌患者多采用化療，但目前仍缺乏特異性的生物標志物和靶向治療藥物，使得胃癌患者治療預后較差，患者生存期較短[1-3]。化療藥物是胃癌新輔助化療和進展期胃癌姑息治療的常見藥物，但腫瘤細胞存在耐藥性，特別是腫瘤多藥耐藥，會嚴重影響化療效果[4-5]。因此，改善胃癌化療藥物敏感性，提高化療治療效果成為胃癌臨床治療的研究熱點。富含絲氨酸和精氨酸的剪接因子1（serine and arginine rich splicing factor 1，SRSF1）作為一種原癌蛋白，在白血病、乳腺癌等惡性腫瘤中均呈高表達[6]。有研究顯示，轉錄因子7類似物2（transcription factor 7 like 2，TCF7L2）是參與WNT通路的關鍵下游靶基因，而WNT通路在胚胎發育和成體干細胞中具有關鍵作用，其在乳腺癌、結腸癌等多種腫瘤細胞中呈現活化狀態[7-8]。但有關SRSF1和TCF7L2在胃癌中表達情況的研究較少。基于此，本研究以胃癌患者作為研究對象，探討SRSF1、TCF7L2在胃癌組織中的表達及與化療藥物耐藥性的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2019年4月至2021年5月于鄭州大學附屬鄭州中心醫院就診的胃癌患者的病歷資料。納入標準：①術前未進行放療、化療或免疫治療；②術前經血液學及影像學檢查排除其他惡性腫瘤疾病；③經病理檢查診斷為胃癌且可耐受手術。排除標準：①有嚴重的肝腎損傷或凝血功能異常；②有嚴重認知功能障礙。根據納入、排除標準，共納入120例胃癌患者，年齡40～85歲，平均（69.26±7.32）歲；男性63例，女性57例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期69例，Ⅲ～Ⅳ期51例；淋巴結轉移47例，淋巴結未轉移73例。本研究經醫院倫理委員會審批通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

對所有患者行胃癌切除術，在無菌環境下取患者腫瘤標本并在距離腫瘤邊緣50 mm外的位置留取癌旁組織標本，應用生理鹽水清洗組織后剔除標本周圍的脂肪組織。選取邊緣生長良好無壞死的腫瘤組織小塊，剪碎后過濾制成細胞懸液。調整細胞密度并進行培養后應用臺盼藍進行計數，將細胞懸液加至每孔190 μl的96孔培養板上進行培養，分別設置只加入培養液的空白組、只加入細胞懸液的對照組和實驗組。實驗組分別加入10 μl化療藥物，分別為順鉑、卡鉑、紫杉醇、多西他賽、多柔比星、環磷酰胺。每組均設置4個復孔。在5% CO2、37℃培養箱中培養24 h，在培養過程中進行稀釋，最終濃度應為人體血漿濃度1 μg/ml。再繼續培養48 h后加入20 μl四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl terazolium，MTT）試劑，繼續培養4 h后再加入150 μl二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），充分振蕩使結晶物充分溶解，再應用酶標儀讀取各孔490 nm處的吸光度值。采用Western blot法檢測患者胃癌組織中SRSF1和TCF7L2蛋白表達量。參照試劑盒說明書提取組織總蛋白并測定蛋白濃度，以β-action作為內參計算蛋白相對表達量。對標本進行切片后應用抗兔二抗進行染色，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）洗后顯色后用蘇木精復染，在光鏡下觀察染色強度。染色強度：黃色、棕黃色、棕褐色分別計1、2、3分。在高倍視野下觀察陽性細胞所占比例，陽性細胞所占比例＜5%計0分，5%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，＞75%計4分。將染色強度評分和陽性細胞所占比例評分相乘：0分（-），1～4分（+），5～8分（++），9～12分（+++）。

1.3 觀察指標

①比較胃癌組織和癌旁組織中SRSF1、TCF7L2相對表達量。②比較不同臨床特征患者SRSF1和TCF7L2表達情況。③分析胃癌組織中SRSF1、TCF7L2表達強度與化療藥物敏感性的關系。藥物抑制率=（對照組吸光度值-實驗組吸光度值）（/對照組吸光度值-空白組吸光度值）×100%。藥物抑制率＜30%為耐藥，30%～50%為低敏，51%～70%為中敏，＞70%為高敏。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行數據統計。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗。計數資料以例數及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。等級資料的比較采用秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌組織及癌旁組織中SRSF 1、TCF 7 L2相對表達量的比較

胃癌組織中SRSF1、TCF7L2相對表達量均明顯高于癌旁組織，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表1）

表1 胃癌組織及癌旁組織中SRSF 1、TCF 7 L2相對表達量的比較（±s）

表1 胃癌組織及癌旁組織中SRSF 1、TCF 7 L2相對表達量的比較（±s）

組織胃癌組織（n=120）癌旁組織（n=120）t值P值0.76±0.06 0.35±0.03 66.953 0.000 0.73±0.06 0.38±0.05 49.090 0.000 SRSF1TCF7L2

2.2 不同臨床特征胃癌患者胃癌組織中SRSF 1、TCF 7L2表達情況的比較

不同性別、年齡和腫瘤直徑胃癌患者的胃癌組織中SRSF1、TCF7L2表達情況比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；不同分化程度、TNM分期及淋巴結轉移情況胃癌患者的胃癌組織中SRSF1、TCF7L2表達情況比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征胃癌患者胃癌組織中SRSF 1、TCF 7 L 2表達情況的比較（ n=120）

2.3 胃癌組織中SRSF 1、TCF7L2表達情況與化療藥物敏感性的關系

不同順鉑、紫杉醇、多西他賽和環磷酰胺耐藥情況的胃癌患者胃癌組織中SRSF1、TCF7L2表達情況比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表3）

表3 胃癌組織中SRSF 1、TCF7 L2表達情況與化療藥物敏感性的關系

3 討論

胃癌作為臨床常見疾病，由于缺乏特異性臨床癥狀，多數患者在早期階段難以有效診斷，胃癌的常規治療手段多為手術、化療和放療[9-10]。由于多數患者在就診時已表現為轉移性胃癌或局部晚期，手術治療后復發可能性高達60%，患者預后較差，術后生存期較短[11-12]。因此，化療仍是胃癌患者臨床治療的重要手段。化療藥物在胃癌化療方案中具有重要地位，該類藥物可將腫瘤細胞的DNA作為靶分子，通過與腫瘤細胞DNA結合來破壞腫瘤細胞DNA的復制從而起到抗腫瘤的作用[13-14]。但隨著化療藥物的廣泛應用，腫瘤細胞的耐藥現象使腫瘤的化療效果受到嚴重影響，甚至導致化療失敗[15-16]。因此，為有效改善胃癌患者化療效果，尋找與化療耐藥性相關的分子標志物具有重要意義。

本研究結果顯示，胃癌患者胃癌組織中SRSF1、TCF7L2相對表達量均明顯高于癌旁組織，差異均有統計學意義。表明在胃癌患者胃癌組織中SRSF1、TCF7L2呈異常高表達，這與既往研究結果基本一致[17]。既往研究表明，SRSF1過表達可能是引起腫瘤發生發展的重要原因[18]。已有研究表明，SRSF1可參與多種復雜的化學生物通路，通過對前體mRNA進行選擇性剪接加工，從而控制下游蛋白表達和功能發揮[19]。因此，SRSF1可調節細胞的凋亡程序，而細胞的凋亡抑制則與腫瘤迅速的發生、發展具有重要聯系。已有研究表明，TCF7L2在腸癌和胰腺癌等腫瘤中具有重要作用，TCF7L2是WNT信號通路的重要轉錄復合物，而WNT信號通路在胃腸道腫瘤的發生發展中具有重要作用[20]。因此。TCF7L2的表達與胃癌患者腫瘤發展具有相關性。本研究進一步表明，不同性別、年齡和腫瘤直徑胃癌患者的胃癌組織中SRSF1、TCF7L2表達情況比較，差異均無統計學意義；不同分化程度、TNM分期及淋巴結轉移情況胃癌患者的胃癌組織中SRSF1、TCF7L2表達情況比較，差異均有統計學意義。表明胃癌組織中SRSF1、TCF7L2高表達可能對胃癌發生、發展產生促進作用。藥敏實驗結果顯示，不同順鉑、紫杉醇、多西他賽和環磷酰胺耐藥情況的胃癌患者胃癌組織中SRSF1、TCF7L2表達情況比較，差異均有統計學意義。表明胃癌組織中SRSF1、TCF7L2的表達情況可能與患者對化療藥物產生的耐藥性有關。這可能與SRSF1異常高表達可促進下游細胞凋亡抑制基因表達，從而引起腫瘤細胞增殖，而TCF7L2異常高表達引起下游腫瘤細胞干性標志物基因過表達，從而引起腫瘤細胞對化療藥物的耐受作用有關，但其確切機制目前尚未明確，仍需進行下一步深入研究。

綜上所述，胃癌患者胃癌組織中SRSF1和TCF7L2呈異常高表達，SRSF1和TCF7L2高表達可能是胃癌患者對化療藥物產生耐藥性的重要原因。