甘薯IbERF071基因的克隆及表達特性分析

徐樂，陳培茹,，劉意,，焦春海，雷劍，王連軍，柴沙沙，靳曉杰，楊園園，程賢亮，楊新筍，張文英

1. 長江大學農學院，湖北 荊州 434025 2. 湖北省農業科學院糧食作物研究所，湖北 武漢 430064

甘薯(Ipomoeabatatas(L.)Lam.)是旋花科(Convolvulaceae)六倍體作物(2n=6×=90，B1B1B2B2B2B2)，它不僅營養豐富，而且具有多種保健功能及藥用價值，是世界第七大糧食作物、我國第四大糧食作物[1]。近年來，我國甘薯產業規模日益擴大，目前栽培面積和總產量均位居全球首位[2]。然而，甘薯病害的發生制約了甘薯產業的發展。其中，甘薯蔓割病又稱鐮刀菌枯萎病(Fusariumoxysporumf.batatas)，是世界甘薯產區的主要病害之一，嚴重影響了甘薯的產量和品質[3,4]。因此，研究甘薯抗蔓割病分子機制對于培育甘薯抗蔓割病新品種具有重要的意義。

乙烯應答轉錄因子(ethylence-responsive element binding factor，ERF)屬于AP2/ERF超級家族(AP2/ERF superfamily)中的ERF亞族，含有一個高度保守的由58或59個氨基酸殘基組成的AP2結構域，具有典型的螺旋-轉角-螺旋結構，保證ERF與GCC-box DNA序列相互作用，參與植物抗病信號傳導，是植物中最大的轉錄因子家族之一[5-7]。大量研究表明，AP2/ERF超級家族中的ERF轉錄因子在抗鐮刀菌枯萎病(真菌病原體)中發揮重要作用。ERF轉錄因子通過與下游啟動子中的順式作用元件結合，激活下游多個防衛基因如致病相關PR(Pathogenesis-related gene)基因的表達量以增強植物對病原菌的抗性[8]。WANG等[9]研究發現，野生葡萄VaERF20基因在擬南芥植株中可以誘導抗病基因的表達，從而提高植株對丁香假單胞桿菌(Pseudomonassyringaepv.tomato)和灰霉菌(B.cinerea)的抗性；ZHANG等[10]研究發現油桐中異源過表達VmAP2/ERF036，可以增強油桐對茄枯萎病病菌(Fusariumoxysporum)的抗性。ERF1的過表達增強擬南芥對壞死性病原體的抗性，如灰霉菌(B.cinerea)、茄枯萎病病菌[11]。基于AP2/ERF超級家族在調節植物抗病防御過程中的重要作用，已在大豆[12]、蘋果[13]、水稻[14]、木薯[15]、棉花[16]、柑橘[17]、本氏煙草[18]、棗[19]等多種植物中進行了研究。目前，關于甘薯中AP2/ERF基因的研究較少。甘薯AP2/ERF基因IbRAP2-12可以提高轉基因擬南芥耐鹽性和耐旱性的作用[20]。甘薯響應蔓割病菌侵染轉錄組分析后發現甘薯中大量與乙烯相關基因被上調或下調表達，且上調表達的基因多于下調表達[21]。在干旱、鹽脅迫和ABA處理后，甘薯IbERF3基因在根和葉片中表達量都顯著上升[22]。IbERF71可與IbMYB340以及IbbHLH2組成復合體與IbANS1啟動子結合來共同調節花青素的生物合成[23]。

目前有關ERF轉錄因子在甘薯抗蔓割病研究中還未見報道。研究以高抗蔓割病甘薯品種‘鄂薯11’為試驗材料，克隆獲得1個編碼乙烯應答的基因IbERF071，并利用生物信息學方法，分析其蛋白理化性質、預測蛋白二級結構及三級結構、比較氨基酸同源性和構建系統發育樹，并利用RT-PCR分析IbERF071基因在鐮刀菌枯萎病病菌(Fusariumoxysporumf.batatas)、茉莉酸甲酯(MeJA)和乙烯利(ETH)處理下不同時間點的基因表達模式，旨在為進一步探索甘薯IbERF071基因在植物抗病中的功能提供科學依據，為甘薯抗蔓割病品種篩選和育種提供新的種質資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為高抗蔓割病甘薯品種‘鄂薯11’，由湖北省農業科學院糧食作物研究所自主選育。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌處理

將鐮刀菌枯萎病病菌接種于馬鈴薯葡萄糖培養基中，置于28℃、200r/min的搖床上避光震蕩一周左右，將菌液孢子濃度調至1×107孢子/mL備用。在田間剪取主莖頂部16cm莖段，選取長勢一致的健康植株，用裝有無菌水的三角瓶(100mL)培養1d，然后轉入鐮刀菌枯萎病菌液中持續侵染，在光照培養箱中培養(28℃，光周期：16h光照，8h黑暗)，處理0、2、4、12、24、48、72h后取甘薯苗的莖部(4cm)，液氮速凍后保存于-80℃超低溫冰箱備用。

1.2.2 激素處理

在田間剪取長勢一致、健康薯苗主莖頂部約16cm莖段，置于1/2霍格蘭營養液中生長1周，選取生長狀態一致的健康植株，然后分別浸入含有0.1mmol/L茉莉酸甲酯和0.05mmol/L乙烯利的1/2霍格蘭溶液中。在光照培養箱中培養(28℃，光周期：16h光照，8h黑暗)，處理0、2、4、12、24、48、72h后取甘薯苗的莖部(4cm)，液氮速凍后保存至-80℃超低溫冰箱備用。

1.2.3 總RNA提取和IbERF071基因克隆

以‘鄂薯11’為材料，使用天漠生物的小量總RNA提取試劑盒提取總RNA，用TransScript?All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(One-Step gDNA Removal)試劑盒(全式金，中國)合成cDNA，-20℃保存備用。在甘薯栽培種六倍體基因組數據庫(https://ipomoea-genome.org/)中blast獲得該基因的編碼區(CDS)序列。利用Premier 5.0軟件設計該序列的特異性引物，正向引物序列為5′-ATGTGTGGGGGTGCAATCCT-3′，反向引物序列為5′-TTAGGCACAGCTGGGATTGA-3′。利用PCR擴增試劑盒TaKaRa La Taq?(TaKaRa，日本)進行PCR擴增，擴增體系總體積50μL，包含cDNA模板2μL、2.5mol/L dNTPs 8μL、LATaq聚合酶0.5μL、10×buffer(Mg2+)5μL、10μmol/L正向引物1.0μL、10μmol/L反向引物1.0μL和蒸餾水32.5μL。PCR擴增程序為：94℃預變性5min；94℃變性30s、55℃退火1min、72℃延伸1.5min，共35個循環；72℃延伸10min，4℃保存。PCR擴增產物用質量體積分數1%瓊脂糖電泳分離，用DNA回收試劑盒EasyPure?Quick Gel Extraction Kit(全式金，中國)將目的片段回收、純化；利用pMDTM19-T Vector Cloning Kit(TaKaRa，日本)試劑盒進行載體連接。將連接產物轉化DH-5α感受態(全式金，中國)，陽性克隆篩選，送至奧科鼎盛生物技術有限公司(武漢)進行測序。

1.2.4 生物信息學分析

利用NCBI的BLASTx(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastx&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)功能，檢索與IbERF071基因編碼的氨基酸序列的同源序列，利用DNAMAN 6.0軟件對同源氨基酸序列進行多重比對；使用MEGA 7.0軟件構建同源序列系統進化樹(neighbor-joining，bootstrap值為1000)；在ExPASy程序(https://web.expasy.org/protparam/)分析IbERF071基因編碼的氨基酸序列的分子質量和等電點；用SMART程序(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)預測IbERF071基因編碼的氨基酸序列的結構域；用SOPMA程序(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL程序(https://www.swissmodel.expasy.org/)預測IbERF071蛋白的二級和三級結構；用TMpred程序(https://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html)預測IbERF071蛋白的跨膜結構，同時使用Cell-PLoc 2.0程序(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)預測該蛋白的亞細胞定位。用Plant CARE程序(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析啟動子順式作用元件，并利用GSDS 2.0在線工具(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)繪圖。

1.2.5 RT-PCR擴增

利用Primer 5.0軟件設計IbERF071基因的熒光定量特異性引物，正向引物IbERF071-F序列為5′-TACCGCCTCCAACTGCTCC-3′，反向引物IbERF071-R序列為5′-TCCCCCAAGGTCGCTGC-3′；以β-Actin基因為內參基因，正向引物序列為5′-AGCAGCATGAAGATTAAGGTTGTAGCAC-3′，反向引物序列為5′-TGGAAAATTAGAAGCACTTCCTGTGAAC-3′。參照PerfectStart?Green qPCR SuperMix試劑盒(全式金，中國)進行PCR擴增，每個樣品3次重復。利用BIO-RAD CFX96實時熒光定量PCR儀(BIO-RAD，美國)進行RT-PCR反應。RT-PCR反應體系總體積為10μL，包含cDNA模板1μL、PerfectStart?Tip Green qPCR SuperMix 5μL、10μmol/L正向引物0.4μL、10μmol/L反向引物0.4μL和Nuclease-free water 3.2μL。擴增程序為：94℃預變性30s；94℃變性5s、58℃退火30s，共40個循環。采用2-ΔΔCt法[24]計算各樣品中基因的相對表達量。

1.3 數據處理

采用Excel 2016和SPSS 26.0統計分析軟件進行數據統計和圖表制作。

2 結果與分析

2.1 IbERF071基因的克隆及生物信息學分析

2.1.1IbERF071基因的克隆

以‘鄂薯11’cDNA為模板進行PCR擴增，得到1條CDS序列為864bp的目的片段(見圖1)，片段長度與預期結果一致，在NCBI在線數據庫中對測序序列進行blastp，其與ERF071基因同源性最高，這與NR數據庫注釋信息吻合，因此將其命名為IbERF071。IbERF071基因共編碼287個氨基酸；在其氨基酸序列的第79至第142位包含1個AP2保守結構域和第205至第254位包含1個卷曲螺旋，說明IbERF071轉錄因子屬于AP2/ERF超級家族。

注： M—DNA maker; 1—IbERF071。 圖1 甘薯IbERF071基因的PCR擴增結果 Fig.1 Results of PCR amplification of IbERF071 gene from sweet potato

2.1.2 氨基酸序列多重比對和同源性分析

多重比對結果和系統進化分析結果(見圖2)表明，甘薯IbERF071基因與牽牛(Ipomoeanil)的氨基酸序列聚為一支、相似度高達89%以上，親緣關系最近；而與其他物種，如芝麻(Sesamumindicum)、原野菟絲子(Cuscutacampestris)、煙草(Nicotianatabacum)、燈籠椒(Capsiumbaccatum)、油橄欖(Oleaeuropaea)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、甜瓜(Cucumismel)、番茄(Solanumlycopersicum)和陸地棉(Gossypiumhirsutum)等，它們的ERF蛋白的氨基酸序列明顯分離，親緣關系較遠。同時，甘薯IbERF071基因與擬南芥ERF家族成員的系統發育樹分析結果(見圖3)顯示：IbERF071基因在進化關系上與AtERF1G基因(AT1G72360.1)接近。

注：IbERF—甘薯;InERF—牽牛(XP_019163870);CcERF—原野菟絲子(VFQ59607);NaERF—煙草(XP_019247451);OeERF—油橄欖(XP_022891565);SiERF—芝麻(XP_011079624);StERF—馬鈴薯(NP_001275232);CbERF—燈籠椒(PHT38746);CmERF—甜瓜(NP_001306244);GhERF—陸地棉(XP_040958415.1);SlERF—番茄(AAO34704)。圖2 甘薯IbERF071基因氨基酸序列的多重比對及同源性分析Fig.2 Multiple alignment and homology analysis of the amino acid sequence of sweet potato IbERF071 gene

圖3 甘薯IbERF071基因與擬南芥AtERFs的系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of sweet potato IbERF071 gene and Arabidopsis AtERFs

2.1.3 IbERF071蛋白結構和理化性質

蛋白質結構預測和理化性質分析結果(見圖4)顯示，IbERF071蛋白的不穩定指數、脂肪系數和總親水性平均系數分別為48.26、47.35和-1.003，分子質量為32215.31ku，等電點為5.12，表明IbERF071蛋白是一種不穩定的親水性蛋白質。該蛋白二級結構的主要元件為隨機卷曲和α螺旋，IbERF071蛋白含有61.67%的隨機卷曲、26.83%的α螺旋、8.01%的延伸鏈和3.48%的β轉角，它們間次分散在整個蛋白質序列中；在該蛋白質的三級結構中，22%的氨基酸殘基結構置信度達到64.06%；亞細胞定位和跨膜結構域的預測結果表明，IbERF071蛋白定位在細胞核中，沒有跨膜蛋白且不存在跨膜螺旋區，表明IbERF071蛋白不能進行跨膜運輸。

圖4 甘薯IbERF071蛋白結構預測結果Fig.4 Prediction result of structure of IbERF071 protein from sweet potato

2.1.4IbERF071基因啟動子區的功能分析

利用甘薯栽培種六倍體基因組數據庫(https://ipomoea-genome.org/)的序列信息，獲得IbERF071基因5′端上游2000bp啟動子序列，分析結果表明(圖5)，IbERF071基因啟動子序列包含多種與抗逆相關的順式作用元件：①典型的真核生物啟動子基本元件CAAT-box和TATA-box；②光響應元件G-box、TCCC-motif、Box 4、ATC-motif、ATCT-motif、ACE、AT1-motif和Chs-unit 1m1；③脅迫響應元件MYB、AAGAA-motif、W box和MYB-like sequence；④茉莉酸甲酯響應元件CGTCA-motif和TGACG-motif；⑤低溫響應元件MYC；⑥干旱誘導元件ERE；⑦脫落酸效應元件ABRE；⑧植物防御響應元件as-1；⑨水楊酸響應元件TCA element;⑩創傷響應元件WUN-motif;MYB結合位點MBS和缺氧特異性誘導中的類增強因子(ARE)等30種順式作用元件。

圖5 在甘薯IbERF071基因啟動子區調控元件的分布順序Fig.5 The distribution order of regulatory element in promoter region of IbERF071 gene from sweet potato

2.2 甘薯IbERF071基因的表達特異性分析

2.2.1IbERF071基因表達的組織特異性

供試甘薯品種‘鄂薯11’的根、莖、葉中IbERF071基因的相對表達量如圖6所示。結果顯示，IbERF071基因在根、莖、葉中均有表達，其根中表達量最高，且在根中表達量顯著(P<0.05)高于莖、葉，說明IbERF071基因在植物抗病防御過程中具有組織特異性。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，圖7、圖8同。圖6 甘薯不同組織中IbERF071基因表達分析Fig.6 Expression analysis of IbERF071 gene in different tissues of sweet potato

2.2.2 蔓割病菌侵染對IbERF071基因表達的影響

利用RT-PCR技術，檢測‘鄂薯11’接種蔓割病菌后IbERF071基因相對表達量的變化。結果(見圖7)表明，在蔓割病原菌侵染下，IbERF071基因相對表達量較對照(處理0h)都顯著增加且2h時表達量達到峰值，為對照(處理0h)的2.78倍；2～24hIbERF071基因的表達量較脅迫2h后顯著降低；隨后表達量在24～72h時逐漸穩定且無顯著差異。結果表明，IbERF071基因的表達量受到蔓割病菌的侵染影響且在脅迫早期進行響應，推測在甘薯響應蔓割病菌脅迫信號的傳導過程中，IbERF071基因在脅迫早期起著重要作用，可作為后續功能分析的候選基因。

圖7 蔓割病原菌侵染下不同脅迫時間IbERF071的相對表達量Fig.7 The relative expression level of IbERF071Fusarium oxysporum f.batatas

2.2.3 植物激素MeJA和ETH誘導IbERF071基因表達

JA和ET信號途徑是植物重要的抗病信號傳導途徑。將16cm的甘薯莖部水培7d后，分別用0.1mmol/L MeJA以及0.05mmol/L ETH進行處理。在0、2、4、12、24、48、72h進行取樣并檢測莖中IbERF071的相對表達量(結果見圖8)。ETH處理48h時IbERF071表達量達到最高，為處理前的5.43倍，而后72h顯著下降，處理12h時的表達量顯著低于其他處理。MeJA處理12h到24h表達量顯著提高，并在72h達最大值，為處理前的6.59倍，其中2、4、48h處理無明顯差異。

圖8 IbERF071在激素MeJA和ETH處理后在莖中的表達模式Fig.8 The expression mode of IbERF071 in stem induced by hormones MeJA and ETH

3 討論與結論

甘薯蔓割病是中國南方薯區發生廣、危害重的真菌性維管束枯萎病，危害部位最初發生在莖基部，隨后地下部蔓莖縱裂，直至枯萎而死；一般減產10%～20%，重者達50%以上[3]。為了找到甘薯生產上蔓割病發生最根本、經濟有效的解決方法，挖掘抗病基因、培育甘薯抗病品種是當前最重要的任務之一。

已有研究表明，AP2/ERF轉錄因子在植物抵抗非生物逆境和生物逆境的過程中都發揮著重要作用[25-28]。ERF家族成員恰好處在植物防御相關信號轉導網絡的交叉點，通過對下游靶基因的調控發揮在植物逆境脅迫響應的作用，但ERF家族成員在植物響應不同逆境脅迫中的功能不盡相同[29]。該研究從高抗蔓割病甘薯品種‘鄂薯11’中克隆獲得的IbERF071基因，通過生物信息學分析，表明該基因CDS序列為864bp，編碼287個氨基酸，包含1個AP2保守結構域和1個卷曲螺旋，無跨膜區這與ERF056相似[30]?；贓RF基因編碼的氨基酸序列構建的系統進化樹中同屬種類物種聚在一起，且與牽牛的ERF基因編碼的氨基酸序列相似度達到89%以上。IbERF071蛋白序列與擬南芥AtERF家族成員進行聚類分析，結果顯示IbERF1071與AtERF071進化關系較近，表明在進化過程中親緣關系最近，氨基酸序列越相似，可能具有相似的功能。通過二、三級結構分析發現該基因含有61.67%的隨機卷曲、26.83%的α螺旋、8.01%的延伸鏈和3.48%的β轉角，這一比例與橡膠草(Taraxacumkok-saghyz)[31]ERF蛋白二級結構的保守性相似，表明不同物種來源的ERF蛋白在二級結構上也具有一定的保守性；在IbERF071基因的啟動子區域含有多個激素應答和逆境脅迫應答相關的元件，這表明IbERF071基因可能參與甘薯防御病原體方面發揮重要作用。

植物在受到外界細菌、真菌、病毒等病原菌侵染時，涉及一系列應答基因和信號轉導途徑，受多種因素的誘導使植物產生抗性，如乙烯(ET)、茉莉酸(JA)、鹽堿、澇漬、低溫、病原菌侵染等[32-35]。研究發現，IbERF071基因在‘鄂薯11’的根、莖、葉中均可表達，但相對表達量存在明顯差異，說明IbERF071基因的表達具有組織特異性，這可能與甘薯不同部位響應植物激素的誘導表達特異性有關。番茄4周幼齡葉片接種灰霉菌后，SlERF.A1基因表達在接種后48h出現最大值，表達量約為對照組的8倍[36]?！跏?1’在接種蔓割病菌后不同脅迫時間的相對表達量也存在差異，0～2hIbERF071基因的表達量與對照組(處理0h)相比顯著增加，且2h時達到最高，為對照的2.78倍，表明IbERF071基因的表達量受蔓割病菌的誘導且在脅迫早期進行響應。JA和ET信號途徑是調控植物抗病信號傳導的主要途徑，甘薯蔓割病抗性受JA信號途徑的正向調控[37]。JA和ET信號途徑均能快速激活乙烯反應基因AtERF1的表達，并在該途徑交叉點的下游起作用[38]。熒光定量分析結果表明IbERF071基因受蔓割病病原菌、MeJA和ETH激素誘導表達，進一步推測甘薯IbERF071在甘薯抗蔓割病菌中的功能與JA/ET介導的激素信號轉導途徑的聯系較為密切，是JA/ET抗病信號傳導途徑中的重要轉錄因子。今后將利用超表達、基因沉默、基因敲除等分子技術對IbERF071基因進行深入研究，探討該基因在甘薯抗蔓割病方面的分子防御功能。