基于網絡藥理學的茯苓甘草湯治療腹水的作用機制研究

郭利偉，劉佳麗，黃琪，余捷，朱依玲，李亞娜，陳靜

長江大學動物科學學院，湖北 荊州 434025

茯苓甘草湯處方源自東漢張仲景所著《傷寒論》，屬祛濕方。該方由茯苓、桂枝、甘草、生姜4味中藥組成，具有溫胃散飲、通陽行水之功效，用于胃虛水停導致的腹水，主癥心悸、汗出不渴、小便不利[1]。目前，針對茯苓甘草湯的文獻報道多為其用于治療肝硬化腹水和冠心病的臨床觀察[2-4]，而關于其發揮通陽行水功效的藥效物質基礎及其多成分、多靶點、多途徑的網絡調節機制尚未見報道。

網絡藥理學是基因組學、拓撲學、計算組學等多學科、多技術的結合運用，在方法學上具有集整體、動態、分析于一體的特點，與中藥復方通過君臣佐使多味中藥協同作用有異曲同工之妙，強調系統性和整體性[5]。網絡藥理學在闡明中藥及其復方制劑的藥效成分及作用機制方面具有傳統方法無法比擬的優勢。因此，本研究利用網絡藥理學方法，對茯苓甘草湯中多個化合物進行了作用靶點和通路預測，通過構建“化合物-靶點-通路-藥理作用-功效”網絡預測茯苓甘草湯治療腹水的機制。

1 材料與方法

1.1 數據庫與分析平臺

中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP)：https://tcmspw.com/tcmsp. php；Uniprot數據庫：https://www.uniprot.org；Drugbank數據庫：https://go.drugbank.com；Genecards數據庫：https://www.genecards.org；String數據庫：https://www.string-db.org；David數據庫：https://david.ncifcrf.gov；PDB數據庫：http://www.rcsb.org/；Pubchem數據庫：https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/。

1.2 茯苓甘草湯活性成分篩選及其靶點的獲取

通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP)預測茯苓甘草湯中茯苓、桂枝、生姜、甘草4味中藥中總化學成分的吸收、分布和代謝。以生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18為標準，并去除重復的化合物，篩選出高活性化合物。

1.3 茯苓甘草湯有效成分靶點標準化

依據篩選出的關鍵化合物通過TCMSP獲取相應的靶點，設置物種為Homo sapiens，再通過Uniprot數據庫和Drugbank數據庫聯合搜索獲取靶點的Symbol簡稱。

1.4 腹水疾病相關靶點獲取并篩選與藥物共有靶點

以“Ascites”為關鍵詞，搜索Genecards數據庫，獲得腹水疾病相關靶點。將篩選出的藥物靶點和疾病靶點繪制韋恩圖。取兩者交集靶點和1.2中篩選的藥物成分，使用Cytoscape軟件繪制“成分-靶點”網絡圖，并使用Network Analyzer工具進行拓撲分析

1.5 PPI網絡構建及拓撲分析

將藥物疾病共有靶點輸入String數據庫進行蛋白互作網絡(PPI)的構建，生物背景設定為Homo sapiens，得到PPI網絡，并將PPI網絡導入Cytoscape中，使用Network Analyzer工具進行拓撲分析，并構建有效成分-共有靶點網絡圖。

1.6 GO富集分析與KEGG通路富集分析

將藥物治療疾病潛在靶點導入David數據庫，設置生物背景為Homo sapiens，進行基因本體(Gene Ontology，GO)生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)、細胞組分(cell component，CC)富集分析；根據京都基因與基因組百科全書(Kyoto-Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)數據庫進行通路富集分析，并繪制柱狀圖和氣泡圖。

1.7 分子對接驗證

根據網絡藥理學分析結果，隨機選取部分成分-靶點網絡的核心靶點和PPI網絡的核心靶點，與成分-靶點網絡的核心成分中度中心性較高的前10種化合物，并分別在PDB數據庫獲取相應的靶點蛋白3D模型和Pubchem數據庫獲取藥物分子3D模型，然后使用SYBYL-X軟件進行分子對接，獲取總分數(total score)值，分值高低表示靶點蛋白與小分子化合物的結合活性，當分值≥4.25，說明分子與靶點具有一定的結合活性；分值≥5，說明有較好的結合活性[6]。

2 結果與分析

2.1 藥物活性成分篩選及其靶點的獲取

利用TCMSP獲取茯苓甘草湯的總成分，其中茯苓34種，桂枝220種，生姜265種，甘草280種化合物，依據生物利用度≥30%和類藥性≥0.18的標準，并去除重復化合物，共獲得117種高活性關鍵化合物(見表1)，對應了252個靶點。

表1 茯苓甘草湯篩選后的有效成分Table 1 Active ingredients in Fuling Gancao decoction after screening

(續表1)

2.2 腹水疾病相關靶點獲取及與藥物共有靶點

查詢上述117個高活性化合物的252個靶點信息，通過Uniprot數據庫和Drugbank數據庫聯合搜索獲取到基因的Symbol名和UniprotID。在Genecard數據庫以“Ascites”為關鍵詞獲取到腹水相關靶點共計2848個，與藥物高活性化合物交集的靶點共計115個(見圖1)。

圖1 茯苓甘草湯靶點與腹水靶點的韋恩圖 Fig.1 Venn diagram of targets of Fuling Gancao decoction and ascites

2.3 高活性成分-疾病藥物共有靶點網絡關系圖

將高活性成分、疾病藥物共有靶點導入Cytoscape軟件中，設置節點與邊線，將其互作關系繪制成可視化“成分-靶點”網絡圖(見圖2)。使用Network Analyzer工具進行拓撲分析，依據度中心性(Degree)、接近中心性(Closeness Centrality)、中介中心性(Betweenness Centrality)大于等于其中位數，平均最短路徑長度(Average Shortest Path Length)小于等于其中位數的規則篩選核心成分和核心靶點，核心成分有42個，包含有槲皮素(quercetin)、β谷甾醇(beta-sitosterol)、山奈酚(kaempferol)、刺芒柄花素(formononetin)、柚皮素(naringenin)、異鼠李素(isorhamnetin)、美迪紫檀素(Medicarpin)、甘草查爾酮A(licochalcone a)等，核心靶點有72個，包含有PTGS2、ESR1、nos、F7、TRPV6、HSP90AB1、AR、PPARG、ARAF、PRSS1等(見圖3)。

注：綠色三角形是疾病與藥物的共同靶點，藍色圓形是高活性成分，并依據中心性設置圖形大小。圖2 成分-靶點網絡圖Fig.2 Component-target network diagram

圖3 “成分-靶點”網絡圖中的核心靶點Fig.3 The core target of “component-target” network diagram

2.4 PPI網絡構建及拓撲分析

將疾病藥物共有靶點導入String數據庫，設置生物背景為Homo sapiens，篩選評分大于等于0.9的蛋白互作關系，建立蛋白互作網絡，除去沒有互作關系的蛋白(見圖4)。該網絡包含98個節點，411條互作關系。其中評分大于等于0.99的互作關系有79條，包含AKT1-GSK3B、BAD-BCL2L1、BCL2L1-TP53、BCL2L1-CASP8、CASP3-CASP8、CCNA2-CDK4、CCNA2-CDK2、CCNA2-CDKN1A、CCND1-CDKN1A、CCND1-CDK2等。數據導入Cytoscape軟件并使用Network Analyzer工具進行拓撲分析，依據度中心性、接近中心性、中介中心性大于等于其中位數，平均最短路徑長度小于等于其中位數的規則篩選出核心靶點，共計33個(見圖5)。

圖4 PPI網絡圖Fig.4 PPI network diagram

圖5 PPI網絡圖中的核心靶點 Fig.5 The core target of PPI network diagram

2.5 GO富集分析

將疾病藥物共有靶點導入David數據庫，設置生物背景為Homo sapiens，進行GO的生物過程(BP)、細胞組分(CC)、分子功能(MF)富集分析，篩選P≤0.05的項目，得到398項生物過程，38項細胞組分，83項分子功能，選取各部分P值最小的前10項繪制柱狀圖，如圖6所示。

圖6 GO富集分析結果Fig.6 The results of GO enrichment analysis

2.6 KEGG通路富集分析

將疾病藥物共有靶點導入David數據庫，設置生物背景為Homo sapiens，進行KEGG通路富集分析，篩選P≤0.05的項目，共計富集到108條信號通路，選取P值最小的前30項繪制氣泡圖，如圖7所示。

圖7 KEGG通路富集分析結果Fig.7 The results of KEGG pathway enrichment analysis

2.7 分子對接結果

根據網絡藥理學分析結果，選取“成分-靶點”網絡的核心靶點和PPI網絡的核心靶點均包含的13個靶點PTGS2、ESR1、AR、BCL2、JUN、CASP3、CASP8、CXCL8、AKT1、TNF、STAT5B、CCND1、RB1，與“成分-靶點”網絡的核心成分中度中心性較高的前10項槲皮素、β谷甾醇、山奈酚、7-甲氧基-2-甲基異黃酮(7-Methoxy-2-methyl isoflavone)、刺芒柄花素、柚皮素、異鼠李素、美迪紫檀素、甘草查爾酮A、2-[(3R)-8,8-dimethyl-3, 4-dihydro-2H-pyrano [6,5-f]chromen-3-yl] -5-methoxyphenol、豆甾醇(Stigmasterol)，將分子對接結果繪制熱圖，如圖8所示。總共進行了120次分子對接，其中分值<4.25的占9.6%；分值≥4.25且<5的占12.8%；分值≥5的占77.6%。選取的超過90%的靶點蛋白與化合物分子都具有一定的結合活性，進一步佐證了基于網絡藥理學辨識有效成分的可靠性。

注：總評分<4.25為白色，4.25～5之間為黃到綠色漸變，≥5為綠到黑色漸變。圖8 分子對接結果熱圖Fig.8 Heat map of molecular docking results

3 討論

茯苓甘草湯主治心下停飲、心悸、汗出不渴、小便不利、咳而遺溺、奔豚，在臨床上常用于腹水的治療。但茯苓甘草湯現有藥理研究基礎薄弱，急需以茯苓甘草湯處方為研究對象，展開物質基礎與作用機制研究，并建立兩者的關聯性，尋找藥物的作用靶點，對其代謝途徑、信號通道等作用機制進行深入研究，同時結合作用機制，論證有效物質基礎，從而使茯苓甘草湯成分明確、藥效可靠、機制清楚，闡明化飲、利水的科學內涵。

“成分-靶點”網絡分析結果顯示，茯苓甘草湯治療腹水是其中多種活性成分協同作用的結果，如槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、刺芒柄花素、柚皮苷等，這與目前基礎及臨床研究的結果相似，證明了本研究預測結果的可靠性[7-14]。ANWER等[7]制備了槲皮素PLGA聚合物納米顆粒，使槲皮素的體內吸收得到了優化，表現出良好的體內利尿活性。β-谷甾醇具有抗微生物、抗炎、抗癌、免疫調節等多種生物學作用[8]，山奈酚是一種類黃酮，可以治療多種急性慢性炎癥、多種肝損傷疾病、抑制血管內皮炎等[9]，刺芒柄花素可減輕腎損傷，用于腎病治療[10,11]，柚皮苷具有較好的免疫調節作用和利尿作用，可用于肝臟疾病的治療[12-14]。而腹水常并發于各種肝病、腎病，茯苓甘草湯的上述活性成分可能是其治療腹水的物質基礎，該結果有待進行進一步的體內試驗驗證。

在“成分-靶點”網絡和PPI網絡的分析中PTGS2、BCL2、JUN、CASP3、CASP8、CXCL8、AKT1等被預測為關鍵靶點。PTGS2與炎癥反應有關，是包括阿司匹林在內的非甾體抗炎藥的主要靶點之一[15]。BCL2可以抑制多種細胞的凋亡[16]。JUN在調節性T細胞的發育分化中起重要作用[17,18]。CASP3與CASP8都屬于細胞凋亡的分子開關，MA等[19]發現熊果酸可以通過調控CASP3抑制肝細胞凋亡來減輕酒精造成的肝損傷，WANG等[20]發現靶向CASP8藥物可以治療非酒精性脂肪性肝炎。CXCL8是一種趨化因子，在炎癥介質的激活、運輸以及癌癥的進展、轉移中至關重要[21]。AKT1可以調節多種生物過程，如代謝、細胞增殖、生長、血管生成等，REYES-GORDILLO等[22]發現AKT1在調節酒精性肝炎及纖維化的發展中起重要作用。

GO富集分析顯示，生物學功能除了如對藥物(GO:0042493)和毒物(GO:0009636)反應等這類正常應激外，主要涉及到如凋亡負調節(GO:0043066)、血管生成(GO:0001525)、平滑肌細胞增殖(GO:0048661)、轉錄正調控(GO:0045893)、細胞遷移正調控(GO:0030335)、器官再生(GO:0031100)等對機體損傷的修復性調節，以及如炎癥反應(GO:0006954)、促進一氧化氮合成(GO:0045429)、對雌二醇的反應(GO:0032355)、對脂多糖的反應(GO:0032496)等這類對炎癥過程的調控。

KEGG通路富集分析顯示，茯苓甘草湯治療腹水主要涉及到的通路有HIF-1通路(hsa04066)、TNF通路(hsa04668)、PI3K-Akt通路(hsa04151)等。ZHANG等[23]發現HIF-1通路可以調節腎臟水和電解質的平衡，抑制腎髓質中的HIF-1α表達有抗利尿的效果。LU等[24]的研究發現，槲皮素可以調節活性氧水平，抑制PI3K-Akt通路所調控的Caspase-3和NF-κB激活，控制炎癥反應和細胞凋亡，進而改善高果糖喂養小鼠的動脈粥樣硬化的發展。PITALOKA等[25]發現，谷氨酰胺可以通過PI3K-Akt通路，影響高脂飲食誘導的肥胖小鼠的肝的糖原分解和糖原異生，調節葡萄糖穩態。TNF信號通路涉及到細胞凋亡、炎癥反應、調節免疫等[26-28]。

綜上所述，通過網絡藥理學的方法分析茯苓甘草湯治療腹水的作用機制是通過多種活性成分作用于多靶點、多通路產生了利尿、調控炎癥過程、調節免疫功能、促進細胞增殖、修復肝損傷等的綜合效果，該結果可為后續深入研究茯苓甘草湯治療腹水的藥理機制提供參考。