哮喘易感基因多態(tài)性與毛細支氣管炎預后的相關性分析

錢前 張玉紅 王宜芬 李偉 劉麗 于艷艷

毛細支氣管炎是嬰幼兒時期常見的喘息性疾病，也是導致嬰幼兒住院的重要病因，其臨床表現輕重不一，以陣發(fā)性憋咳、喘息及氣促為臨床表現，在世界范圍內廣泛流行[1]。哮喘是兒童時期最常見的慢性氣道疾病，喘息反復發(fā)作影響患兒身心健康，也給家庭及社會造成經濟負擔[2]。有研究報道因毛細支氣管炎住院的患兒中約22%～48%發(fā)展為兒童哮喘[3]，由此可見部分毛細支氣管炎很可能是兒童哮喘的早期階段，如何從毛細支氣管炎患兒中甄別出哮喘高危兒以早期管理及干預，是減少哮喘發(fā)病率的重要舉措。哮喘作為一種異質性疾病，其發(fā)生、發(fā)展與遺傳背景密切相關，研究表明哮喘易感基因SNPs IL13 A2044G、IL4-590C>T、ADRβ2 R16G 和 FcεR1β E237G與漢族兒童哮喘發(fā)生密切相關[4]，本文旨在探討上述位點與毛細支氣管炎后喘息情況的相關性，為甄別毛細支氣管炎中的哮喘高危兒提供參考。

資料與方法

一、研究對象

納入2018年12月—2020年01月在連云港市婦幼保健院兒童呼吸科住院的毛細支氣管炎患兒132例，其中男95人，女37人。入選標準：(1)年齡1～24月，性別不限；(2)符合第八版《諸福棠實用兒科學》中毛細支氣管炎診斷標準；(3)所有患兒入組前均未使用吸入性及全身性糖皮質激素，未使用抗組胺藥物；(4)無繼發(fā)細菌感染；(5)排除支氣管異物、先天性心血管疾病、免疫缺陷病、胃食管反流、先天性氣道發(fā)育異常等疾病。所有研究均得到患兒家長同意且簽署知情同意書，同時獲得我院醫(yī)學倫理委員會批準。

二、研究方法

1.分組方式 納入對象以既往是否有醫(yī)師診斷的特異性皮炎病史作為依據，分為特應性體質組(atopic group，簡稱A組)63人、非特應性體質組(non-atopic group，簡稱N組)69人。

2.哮喘易感基因檢測

(1)基因組DNA提取：兩組患兒采集口腔黏膜拭子后，口腔拭子基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取 DNA。

(2)引物設計：參照 GenBank 中人 DNA 基因序列，在NCBI網站上查詢包含相應位點的基因序列，確定相應的突變位點，利用Primer5.0軟件設計 PCR引物，引物序列見(表1)。

表1 基因擴增引物序列

(3)Massarray SNP 分型技術對多態(tài)性位點進行基因分型：多重 PCR 反應：模板 DNA 2 μL，熱啟動 Taq DNA 聚合酶0.2μL，擴增引物各為 0.5 μL，25mM/L dNTPs 0.1 μL，25mM/L MgCl20.4 μL，PCR緩沖液0.5 μL，水0.8μL，反應體積為5 μL；反應條件為 95℃ 2 min，(95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min)×45 cycles，72℃ 5 min；4℃保存。

蝦堿性磷酸酶(SAP)反應：PCR 產物 5 μL，SAP 緩沖液0.17 μL，SAP酶0.30 μL，水1.53 μL。反應條件為：37℃ 40 min，85℃ 5 min，4℃保存。

延伸反應：SAP處理后 PCR 產物 7 μL，iPLEX緩沖液0.2 μL，iPLEX混合物0.2 μL，iPLEX 酶為0.04 μL，延伸引物混合物0.94μL，水0.62 μL。反應條件為：94℃ 30 s，[94℃ 5 s，(52℃ 5 s，80℃ 5 s)×5 cycles]×40 cycles，72℃ 3 min，4℃保存。

芯片點樣：將所得產物脫鹽處理，用 MassARRAYTMRS 1000 點樣儀將樣本點到對應的 SpectroCHIP(芯片)上，使用 MALDI-TOF(基質輔助激光解吸電離-飛行時間)質譜儀獲得數據，進行基因分型并輸出結果。

3.呼出氣一氧化氮檢測 采用無錫尚沃醫(yī)療電子SV-O2納庫侖一氧化氮分析儀測定患兒FeNO 水平。檢測時患兒處于自然睡眠或水合氯醛鎮(zhèn)靜睡眠狀態(tài)，用采氣面罩連接采氣袋后，緊扣被檢查者的口鼻處，防止漏氣，在平靜呼吸狀態(tài)下取樣品氣，對樣品氣體進行離線檢測[5]。

4.血常規(guī)檢測 入院24小時內常規(guī)采集靜脈血檢測外周血嗜酸性粒細胞(Eosinophil，EOS)比例。

三、隨訪指標

對入選所有毛細支氣管炎患兒在出院后3月、6月、9月、12月時進行隨訪，隨訪指標：喘息情況、喘息次數。

四、統(tǒng)計學分析

結 果

一、研究對象一般情況

共納入132例漢族毛細支氣管炎患兒，其中A組63人，男48人(76.2%)，女15人(23.8%)，平均年齡(12.10±6.57)月，N組69人，男47人(68.1%)，女22人(31.9%)，平均年齡(11.35±6.58)月，兩組間性別，年齡均無顯著差異(P>0.05)(見表2)。

表2 兩組毛細支氣管炎患兒人口統(tǒng)計學比較

二、毛細支氣管炎臨床數據分析

132例毛細支氣管炎患兒，出院后一年內有喘息發(fā)作人數92人(69.7%)，其中A組毛細支氣管炎患兒外周血嗜酸性粒細胞比例、出院1年內發(fā)生喘息再發(fā)人數、喘息再發(fā)次數均顯著高于N組(P<0.05)。A組呼出氣一氧化氮(FENO)水平較N組升高，但無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(見表3)。

表3 兩組毛細支氣管炎患兒臨床數據比較

三、兩組間哮喘易感基因基因型比較

A組哮喘易感基因SNPs ADβ2 R16G以 AA型頻率最高，其次是AG型，GG型頻率最低，N組以AG型頻率最高，AA型頻率次之，GG型頻率最低，組間比較具有顯著性差異(P<0.05)。IL13 A2044G、IL4-590C>T、FcεR1β E237G位點基因型分布在兩組間均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(見表4)。

表4 兩組間哮喘易感基因單核苷酸多態(tài)性基因型分布[n(%)]

討 論

毛細支氣管炎是2歲以下患兒所特有的下呼吸道感染，以氣道阻塞所致的氣促和喘鳴為特征，肺部聽診可聞及哮鳴音、濕啰音，其流行范圍廣，6月齡以下毛細支氣管炎患兒常需住院治療。近年來，大量研究發(fā)現毛細支氣管炎與日后反復喘息乃至哮喘發(fā)生密切相關，特應性體質和早期重癥毛細支氣管炎可能是日后發(fā)展為哮喘的高危因素[1]。鑒于不斷攀升的的哮喘發(fā)病率以及哮喘對患兒生理、心理發(fā)育的影響乃至對家庭和社會造成的負擔，需早期甄別哮喘高危兒，納入管理、及時防治，以降低兒童哮喘發(fā)病率。

5歲以下兒童哮喘診斷缺乏統(tǒng)一標準，且引起嬰幼兒喘息發(fā)作的因素復雜，故難以精準做出哮喘診斷。2000年提出的哮喘預測指數(asthma predictive index，API)，目前廣泛用于評估5歲以內喘息嬰幼兒日后發(fā)展為哮喘的風險，然而API雖具有較高的特異度，但靈敏度不足，限制了在中等風險以及喘息次數小于4次的患兒中使用[6]。因此在更早期甚至在嬰兒喘息臨床表型尚未顯現的毛細支氣管炎階段，探討可以識別的哮喘高危風險指標十分必要。

哮喘是一種異質性疾病，哮喘易感基因在哮喘發(fā)生發(fā)展中起重要作用，可以用于預測哮喘發(fā)病風險，毛細支氣管炎是嬰幼兒生命早期喘息的獨有形式，特應性體質、毛細支氣管炎后反復喘息是毛細支氣管炎向哮喘發(fā)展的風險因素[7]，本研究擬探討哮喘易感基因與不同體質毛細支氣管炎及毛細支氣管炎后喘息的相關性，以指導哮喘高危風險患兒納入管理，實現哮喘的二級預防。

一、臨床資料在兩組間的差異

本研究以隊列初期是否曾患特應性皮炎進行分組，進行為期1年隨訪，對兩組間入院時外周血嗜酸性粒細胞(EOS)水平、呼出氣一氧化氮(FENO)水平、發(fā)生喘息人數以及喘息次數進行對比。研究發(fā)現A組嗜酸性粒細胞水平顯著高于N組，與張奕等報道一致[8]，提示A組患兒體內存在嗜酸性粒細胞性炎癥。通過趨化粘附募集在氣道黏膜的嗜酸性粒細胞可進行脫顆粒釋放多種炎癥因子，如嗜酸性粒細胞陽離子蛋白等，導致氣道高反應性以及肺組織損傷。有報道稱毛細支氣管炎期間嗜酸性粒細胞水平降低與一過性喘息相關，而嗜酸性粒細胞水平顯著升高則預示著3歲以內反復喘息[9]。本研究經隨訪發(fā)現，A組無論是再次喘息人數占比還是個體喘息再次發(fā)生次數都顯著高于N組，與既往研究一致。T?rm?nen S等發(fā)現2歲以內因毛細支氣管炎住院的患兒在12～13歲時患哮喘的風險高2.6～5倍，其風險因素為特應性皮炎、反復喘息、外周血嗜酸性粒細胞增多[7]，本研究中特應性毛細支氣管炎患兒嗜酸性粒細胞增多、易反復喘息，從一定層面證明了特應性體質毛細支氣管炎患兒哮喘發(fā)病風險更高。本研究還發(fā)現毛細支氣管炎患兒出院后1年內再喘息的發(fā)生率高達69.7%，特應性體質組再喘息率更是高達88.9%，因此將毛細支氣管炎群體納入長期隨訪管理或更有益于患兒喘息的規(guī)范診療。

呼出氣一氧化氮(FENO)檢測是檢測氣道嗜酸性粒細胞炎癥水平的首選方法，其具備無創(chuàng)、操作便利、可重復性好等特點，被用于輔助診斷、管理兒童哮喘以及指導、評估吸入性糖皮質激素的使用。由于嬰幼兒配合度不夠，干擾因素多，潮氣離線測定公認度不夠，且缺乏不同年齡段嬰幼兒標準值參考，FENO在毛細支氣管炎患兒中的診療價值存在爭議，研究結果也常不一致[10]。本研究發(fā)現A組FENO值高于N組，但是無顯著統(tǒng)計學差異。因此FENO在毛細支氣管炎中評估氣道炎癥水平的意義有待進一步探討。

二、哮喘易感基因在兩組間的差異性

近些年，隨著分子生物學和遺傳學的發(fā)展，對易感基因在哮喘發(fā)生、發(fā)展方面作用的探討不斷深入。易感基因多態(tài)性，即單堿基對變異是發(fā)生哮喘主要的風險因素。了解這些變異基因有助于研究哮喘發(fā)病機制、預測哮喘發(fā)生、加速抗哮喘藥物研發(fā)以及實現個體精準靶向治療等[11]。有研究指出四個哮喘易感基因SNPs IL13 A2044G、IL4-590C>T、ADRβ2R16G 和 FcεR1β E237G，任何一個基因位點對哮喘的發(fā)展具有獨立影響，綜合四個基因在哮喘預測方面具有協(xié)同效果[4]。也有文獻報道上述四個位點與哮喘預測指數陽性嬰幼兒具有相關性[12]，然而這些基因位點與毛細支氣管炎相關性探討目前鮮有報導。

位于染色體5q31上的β2腎上腺素能受體基因，其至少存在9個突變位點，其中一個重要突變位點即ADRβ2R16G，氨基酸位點16表達精氨酸還是甘氨酸由基因A或G決定，與β2腎上腺素能受體的敏感度下調有關[13-14]。本研究顯示A組AA基因型頻率顯著高于N組，而GG基因型頻率A組低于N組，兩組間存在顯著統(tǒng)計學差異。說明ADRβ2R16G易感基因多態(tài)性與不同體質的毛細支氣管炎存在關聯(lián)，其中AA基因型頻率在A組患兒中表達增高，而這部分患兒隨訪數據顯示，無論是喘息再次發(fā)作的次數和人數均明顯高于N組患兒，提示A組患兒具有明顯的哮喘傾向，由此推測ADRβ2R16G易感基因的AA基因型高頻率及GG基因型低頻率對預警毛細支氣管炎后喘息及哮喘發(fā)作風險，具有一定價值。既往研究也表明AA純合子基因型與氣道高反應性及哮喘嚴重程度相關，而純合子GG基因型對嚴重哮喘的發(fā)展具有保護作用[14]。與本研究的推論一致。

IL13基因位于染色體5q31-33，IL13 A2044G是IL13基因單核苷酸多態(tài)性突變位點之一。參與調節(jié)IgE合成，與過敏性哮喘的發(fā)生密切相關。也有研究表明此基因多態(tài)性分布在哮喘組和對照組之間無顯著差異[13,15]。本研究顯示該位點AA、AG、GG基因型分布頻率在兩組間并無顯著差異。表明IL13 A2044G基因多態(tài)性分布在兩組間無統(tǒng)計學差異。

人類IL4基因位于染色體5q31，目前已發(fā)現超過50個多態(tài)性突變等位基因位點，IL4-590C>T位點位于IL4基因啟動子區(qū)域，可增強IL4活性以及修飾IL4基因轉錄，與血清IgE水平升高及哮喘發(fā)生相關[16]。本研究兩組中此基因位點均以TT基因型分布頻率最高，CT基因型次之，CC基因型分布頻率最低，組間無統(tǒng)計學差異。

FcεR1由三個亞基形成的異四聚體構成，信號傳導增強亞基FcεR1β由 FcεR1β E237G編碼，此多態(tài)性位點堿基由A變成G，可使氨基酸殘基237由谷氨酸替代為甘氨酸，影響高親和力受體的胞內信號傳導，與血清總IgE、特異性IgE水平及過敏性哮喘發(fā)生密切相關[13,17]。本研究結果顯示此多態(tài)性位點基因型在兩組間分布，均以AA基因型頻率最高，GG基因型頻率最低，組間無顯著差異。國內一項研究指出API陽性喘息患兒AG基因型分布頻率明顯高于API陰性喘息患兒[13]，與本研究存在不一致性，考慮可能與病例對照分組方式不同以及地區(qū)差異性有關。

綜上，哮喘易感基因SNPs ADRβ2 R16G與特應性體質毛細支氣管炎密切相關，ADRβ2 R16G易感基因的AA基因型高頻率及GG基因型低頻率對預警毛細支氣管炎后喘息及哮喘發(fā)作風險具有一定價值，可作為毛細支氣管炎后喘息乃至哮喘傾向的高危指標，宜將此類患兒納入哮喘高危人群管理以實現哮喘的二級預防。

本研究尚存在一些局限性，比如隨訪時間短，對病情輕重不同的毛細支氣管炎患兒沒有進行分組隨訪等。下一步我們將擴大樣本量，對病情輕重不同的毛細支氣管炎患兒進行相關性分析，并延長隨訪時間，以哮喘發(fā)生的節(jié)點分組探討哮喘易感基因在毛細支氣管炎中的預測價值，為阻止哮喘的發(fā)生發(fā)展提供更有價值的參考指標。