肺泡灌洗液宏基因組二代測序對疑似肺結核的診斷價值

趙素娥 高欣 劉勝崗 龍靜 周麗華

肺結核是由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染引起的呼吸系統傳染病，我國肺結核發病率及死亡率位居所有傳染病首位，為全球第2位[1]。控制結核病的關鍵環節是控制傳染源，因此肺結核患者的早發現、早診斷顯得尤為重要。傳統的羅氏培養方法周期長，陽性率低，不能滿足臨床快速診斷的需要。近年來，宏基因組二代測序技術(metagenomic nextgeneration sequencing，mNGS)發展迅速，它能對微生物的DNA或RNA進行快速測序的技術，對感染性疾病的診斷具有一定的價值[2-4]。本研究對同期進行MTB痰涂片和培養，肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)涂片和培養、熒光定量PCR、Xpert MTB/RIF(簡稱Xpert)及BALF mNGS檢測的患者進行回顧性分析，旨在探討BALF mNGS檢測對肺結核早期診斷的價值。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2020 年5月22日至2021年2月20日長沙市中心醫院收治、同步行痰液及BALF抗酸染色涂片法、MTB培養法，BALF TB-DNA或Xpert檢測及BALF mNGS的疑似肺結核患者，且尚未使用抗癆藥物。排除標準：年齡在18歲以下、近期有抗結核治療史、臨床資料不完整、未同時進行抗酸染色涂片法、MTB培養法及mNGS檢測、診斷不明確者。最終納入155例，男106例，女49例，年齡(59.05±16.45)歲。根據臨床診斷標準，最后診斷為肺結核95例(肺結核組)，男72例，女23例，年齡(59.30±16.46)歲；診斷為非肺結核60例(非結核組)，其中感染性疾病54例，嗜血細胞綜合征1例，惡性腫瘤5例，男34例，女26例，年齡(58.66±16.58)歲。本研究通過長沙市中心醫院倫理委員會批準(批件號：2021-S0197)。

肺結核診斷標準參照《肺結核診斷》(WS 288-2017)[5]，臨床診斷標準為：(1)結合影像特征和結核免疫學檢測陽性，排除其他疾病，且抗結核藥物治療經評估有效。確診標準：(2)具有病原學或者病理診斷依據，或采用現代分子生物學檢測手段(PCR法、基因檢測等)結合臨床資料等進行綜合分析的確診患者。

二、標本采集

采用日本產Olympus BF-260型電子支氣管鏡灌洗病變肺段，重復灌洗肺部2～3次，收集肺泡灌洗液。

三、檢測方法

1 常規MTB檢查方法 涂片按照《中國結核病防治規劃痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證手冊》中的 標準化操作程序，采用美國BACTEC MGIT 960全自動快速分枝桿菌培養鑒定藥敏儀，具體操作方法參照儀器說明書。

2 熒光定量PCR檢測 運用博奧生物有限公司核酸提取儀提取肺泡灌洗液的結核分枝桿菌DNA(TB-DNA)，然后運用美國ABI-7500基因擴增儀檢測，具體操作參考試劑說明書。

3 Xpert MTB/RIF檢測 Xpert MTB/RIF按照美國Cepheid公司生產的利福平耐藥實時熒光定量核酸擴檢測系統儀器使用說明書進行操作。

4 宏基因組二代測序技術檢測 取肺泡灌洗液5 mL以上，送至湖南圣維爾醫學檢驗中心檢測，進行核酸提取及建庫和上機測序，最后進行生信分析及報告，分析流程為：①過濾原始數據中低質量序列及接頭序列，②初步質控后數據，③去人源及常見背景微生物序列，④比對微生物數據庫(來源：NCBI-RefSeq&Genbank數據庫(12800+種)，細菌6600種，真菌980種，病毒5000種，寄生蟲222種，分支桿菌171種，支原體/衣原體97種)，⑤依據比對情況進行二次過濾，對種屬信息進行統計(NCBI-nt數據庫二次比對，與陰性control集進行比較去除假陽性物種)，⑥最終結果列表。

mNGS報告的解讀依據《宏基因組高通量測序技術應用于感染性疾病病原檢測中國專家共識》簡稱《中國專家共識》[6]，符合下列標準：①若二代測序結果符合患者的臨床表現和其他實驗室檢查，推薦根據二代測序結果指導臨床決策。②若二代測序結果陽性且符合臨床表現，但缺乏除二代測序結果外的其他實驗室支持證據，應進行PCR驗證(在具有合適引物的條件下)，并建議臨床進一步完善可獲得的傳統實驗室檢查加以驗證。③若二代測序結果陽性，但臨床表現或實驗室檢查結果不支持該結果，則不能僅根據二代測序結果進行診斷，而應以傳統實驗室檢查結果為首要臨床參考依據。MTB為胞內致病菌，豐度較低，污染可能性小，當至少1個讀數被映射到種或屬水平時，MTB被認為是陽性的[7]。

四、統計學處理

使用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，計數資料采用“例”和“率(%)”表示；最終臨床診斷為參考標準，計算常規檢測方法與BALF mNGS在肺結核中的敏感度，特異度，陽性預測值，陰性預測值；組間比較采用 χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、實驗室檢測結果

95例肺結核組中，BALF mNGS檢出MTB陽性55例。肺結核組中，24例(25.26%)合并真菌感染(包括5例耶氏肺孢子菌)，以白色念珠菌居多，40例(42.11%)合并細菌感染(見表1)。非肺結核患者60例，以肺部感染和支氣管擴張合并感染多見(見表2)。

表1 肺結核組病原菌種類及占比

表2 非肺結核組病種及占比

二、mNGS MTB檢測陽性者最終均診斷為肺結核，無假陽性；真菌或細菌檢測陽性者

根據臨床、實驗室、影像學和痰液/肺泡灌洗液培養結果綜合判斷后進行臨床干預。肺結核組中，mNGS及傳統方法(痰及BLAF)共診斷24例合并真菌感染(包括5例耶氏肺孢子菌感染)，均合并2種及以上病原菌感染，且均入住結核ICU，并進行了針對性的抗真菌治療。肺結核組中，mNGS及傳統方法(痰及BLAF)共診斷40例合并細菌感染，其中mNGS及傳統方法一致者11例，mNGS檢出病原體而傳統方法未檢出者19例，傳統方法檢測出而mNGS未檢出者10例。38例進行了針對性的抗感染治療，2例僅使用抗癆藥物。

非結核組60例，5例惡性腫瘤患者進行了化療或靶向治療及參考病原學進行抗感染治療。嗜血細胞綜合征1例轉血液科繼續治療。5例非結核分枝桿菌肺病，3例進行抗NTM治療，2例要求轉上級醫院治療。其他合并細菌或真菌感染者參考mNGS結果進行了治療。

三、mNGS診斷肺結核的陽性率與常規檢測方法的比較

以最終臨床結果為參考標準，mNGS診斷肺結核的陽性率為57.89%(55/95)，高于痰抗酸染色涂片法(27.37%，26/95)和痰快培法(30.53%，29/95)，也明顯高于BALF抗酸染色涂片法(15.79%，15/95)和BALF快培法(20.00%，19/95)，差異均有統計學意義(P<0.001)；但與BALF Xpert(58.33%，21/36)相比，差異無統計學意義(P=1.00)；略高于BALF TB-DNA(50%，31/62)，差異無統計學意義(P=0.09)(見表3)。

表3 mNGS與常規檢測方法陽性率比較

四、mNGS診斷肺結核的效能與常規檢測方法的比較(見表4)。

表4 mNGS與常規檢測方法效能比較

討 論

肺結核是嚴重危害人類健康的公共問題，早期診斷并及時治療對控制肺結核的傳染性尤其重要。羅氏培養法為經典的診斷肺結核的“金標準”，但培養周期長，約4～6周，陽性率低。涂片抗酸染色法簡便、快捷，但陽性率亦低。對于無咳痰或痰液含菌量少的患者，支氣管肺泡灌洗液(BALF)抗酸染色涂片及快培成為輔助診斷肺結核的重要工具，但BALF抗酸染色檢測結核桿菌要求標本濃度較高，研究顯示[8]，BALF抗酸染色涂片陽性率為15%，診斷價值有限。

隨著分子生物學技術迅速發展，PCR是近年新發展的分子與基因相結合的方法，具有較高的靈敏度和特異度，能快速、準確地診斷肺結核[9]。TB-DNA檢測技術是通過對DNA片段進行放大擴增，并借助熒光標記探針對結核桿菌DNA擴增序列進行定量檢測的一種檢測方法。2018年實施的結核病診斷“新標準”增加了TB-DNA檢測作為結核病診斷新指標[5]。而Xpert檢測技術是半巢式實時熒光定量 PCR技術優化，可通過檢測結核分枝桿菌特有的序列rpoB基因與利福平耐藥相關的81 bp核心區間[10-11]，能準確、有效檢出結核分枝桿菌和利福平耐藥的情況，且其檢測時間明顯縮短。TB-DNA和Xpert檢測肺結核有較高的診斷價值，但肺結核患者多為混合感染，尤其對于危重癥患者，二者不能檢測其他病原體。

mNGS不基于培養，直接從環境/臨床樣本中提取全部微生物的核酸，利用基因組學的方法研究環境/樣本中所包含的全部微生物的遺傳組成及其群落功能，可廣泛分析臨床樣本中微生物組(細菌、真菌、病毒、結核等)的高通量測序方法。該技術可準確檢測出標本中的MTB[12-13]?；仡櫺匝芯匡@示其診斷肺結核的敏感度為59%，顯著高于培養法(26%)[8]。本研究結果顯示，BALF mNGS診斷肺結核的敏感度為57.89%，顯著高于痰涂片法、痰培養法及BALF涂片法及BALF培養法，特異度100%，這與研究一致。這里BALF涂片法及培養法診斷肺結核的敏感度低于痰涂片法、痰培養法，考慮可能與標本濃度稀釋有關，提示我們，有自主咳痰能力的患者盡量多次送檢痰涂片或培養。既往研究顯示，對于呼吸道樣本，mNGS對于結核分枝桿菌的檢出率并不優于GeneXpert[14]。本研究顯示BALF mNGS診斷肺結核的陽性率與BALF Xpert(58.33%，21/36)和BALF TB-DNA(50%，31/62)相比，差異無統計學意義。原因考慮為結核分枝桿菌細胞壁比較厚[15]，破壁困難，常規核酸提取方法難以保證核酸提取的質量。

《中國專家共識》[6]指出，各種原因導致患者急危重癥表現，不除外感染所致，或考慮繼發或并發危及生命的嚴重感染，建議常規檢測的同時，開展mNGS。95例肺結核患者，共35例入住結核重癥監護室，13例行氣管插管，10例合并膿毒癥休克。mNGS檢測出2種及以上病原體者63例(66.32%)，24例(25.26%)合并真菌感染，17例僅抗癆治療，82.11%(78/95)為混合感染，根據病原學進行了治療調整。提示在危重癥感染患者或考慮存在混合感染的病例中，mNGS可提供準確的病原菌診斷信息，減少了臨床經驗性廣譜抗生素的使用，可以快速、準確地指導治療。

綜上所述，BALF mNGS診斷肺結核的敏感度、特異度和陽性預測值顯著高于涂片法及培養法，但與BALF TB-DNA及BALF Xpert的陽性率比較無統計學差異。提示我們，對于輕癥疑似肺結核患者，不建議行mNGS檢測；對于疑難危重疑似肺結核患者mNGS為一種快速、全面檢測病原體的診斷方法。