柚皮素對急性肺損傷小鼠保護作用的機制研究

陳倩倩 王榮麗

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是一種危及生命的臨床綜合征，其特征是肺泡上皮損傷和肺水腫液大量聚集引起的呼吸衰竭和頑固性低氧血癥[1]。有效清除肺水腫液可以改善氧合功能并縮短機械通氣時間[2]。血清和糖皮質激素誘導激酶1(SGK1)參與Na+主動轉運及肺水腫液的清除[3]。Na+通過鈉通道(ENaC)進入肺泡上皮細胞，進而被鈉鉀泵(Na+-K+-ATPase)泵出，由此產生的滲透壓驅動水的重吸收[4]。其中，α-ENaC和Na+-K+-ATPase α1具有重要作用[5-6]。柚皮素廣泛存在于柑橘等水果中，具有抗氧化、抗炎和抗腫瘤作用[7]。研究表明柚皮素能減輕ALI小鼠肺部炎癥[8-9]。然而，柚皮素能否通過SGK1通路保護脂多糖誘導的ALI仍有待研究。本研究用脂多糖構建ALI小鼠模型，以柚皮素預處理，探討對ALI小鼠的治療作用及可能的作用機制。

資料與方法

一、實驗動物、試劑、儀器

4～6周齡雌性BALB/c小鼠15只，體質量約20g，購自湖北省實驗動物研究中心，許可證號：SCXK(鄂)2020-0018，飼養條件：室溫20℃，空氣濕度50%～55%，晝夜12h，嚴格按照標準喂養。柚皮素、脂多糖購自上海阿拉丁公司；TNF-α、IL-1β 酶聯免疫測定試劑盒購自武漢ELK公司；磷酸化SGK1抗體(p-SGK1 Ser422)購自美國Sigma公司；α-ENaC、Na+-K+-ATPase α1、GAPDH 抗體購自美國Abcam公司；RIPA總蛋白裂解液、BCA蛋白質濃度測定試劑盒購自武漢ASPEN公司；全自動酶標儀購自Diatek公司；全自動血液分析儀構自瑞士羅氏公司。

二、動物分組及造模

15只BALB/c小鼠適應性喂養7天后，隨機分成Control組、LPS組、LPS+Nar組，n=5。模型制備[7-8]：LPS+Nar組予以柚皮素(100mg/kg)灌胃預處理，連續4天，每天1次，Control組和LPS組予以等量生理鹽水灌胃。末次灌胃2h后腹腔注射4%水合氯醛麻醉小鼠，固定于操作臺上，LPS+Nar組和LPS組氣管內一次性滴入脂多糖(5mg/kg)建立小鼠ALI模型，Control組氣管內滴入等量生理鹽水，各組小鼠于造模成功后24h取腹主動脈血、雙肺組織待檢。

三、肺組織病理學觀察

收集各組小鼠右肺上葉組織，洗凈后放于4%多聚甲醛中固定、脫水、石蠟包埋、5μm厚切片，HE 染色觀察肺組織病理改變。

四、動脈血氧分壓(PaO2)及氧合指數(OI)檢測

小鼠處死前，用肝素注射器經腹主動脈抽取動脈血0.5 mL進行血氣分析，測定PaO2，并計算氧合指數(Oxygenation index，OI=PaO2/FiO2，FiO2取21%)。

五、肺組織濕/干比值(W/D)測定

取右肺下葉組織精確稱重，記為濕重(W)，然后放置于75℃烤箱中烘烤36h至恒定重量后稱重，記為干重(D)，計算肺組織W/D值。

六、ELISA 法檢測肺組織中TNF-α、IL-1β表達水平

取少許左肺上葉組織用勻漿器充分勻漿，離心后收集上清液，按照試劑盒說明書進行操作，在450 nm波長處測定各孔的OD值，根據標準曲線計算肺組織中TNF-α、IL-1β含量。

七、Western blot法檢測肺組織中p-SGK1、α-ENaC、Na+-K+-ATPase α1蛋白表達

我國現存最早的私家藏書樓是天一閣。始建于明朝嘉靖四十年（公元1561年），位于位于浙江寧波的天一閣，由范欽主持建造，所藏各類書籍達七萬余卷。是中國現存最早的私家藏書樓，也是世界最早的三大私家圖書館之一。

取適量左肺下葉組織，加入RIPA裂解液，收集上清液測定總蛋白濃度，SDS-PAGE 凝膠電泳，轉膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1h，洗膜后加入α-ENaC 抗體(1∶1000)、p-SGK1抗體(1∶500)、Na+-K+-ATPase α1抗體(1∶500)，4 ℃搖床過夜，TBST 洗膜3次，每次5 min，加入對應的辣根過氧化物標記的二抗37 ℃孵育30min，TBST洗滌4次，每次5 min，ECL 顯色，使用圖像分析系統對蛋白條帶進行掃描，計算各蛋白的相對表達量。

八、統計學處理

結 果

一、造模后各組小鼠一般情況

Control組精神較好、反應靈活、呼吸平穩、活動及進食正常；LPS組精神萎靡、反應遲鈍、嘴唇發紺、呼吸急促、尿少、活動及進食明顯減少；LPS+Nar組小鼠一般情況介于Control組和LPS組之間，精神尚可，活動及進食有所減少。

二、Nar對ALI小鼠肺組織病理變化的影響

圖1 各組小鼠肺組織病理改變(HE×200)

三、Nar對ALI小鼠PaO2、OI、W/D的影響

與Control組相比，LPS組腹主動脈血PaO2、OI降低(均P<0.05)；與LPS組相比，LPS+Nar組PaO2、OI升高(均P<0.05)。與Control組相比，LPS組肺組織W/D值增加(P<0.05)；與LPS組相比，LPS+Nar組W/D值降低(P<0.05)(見表1)。

表1 各組小鼠動脈血氧分壓、氧合指數及濕干重比

四、Nar對ALI小鼠肺組織TNF-α、IL-1β表達水平的影響

與Control組相比，LPS組肺組織TNF-α、IL-1β表達升高(均P<0.05)；與LPS組相比，LPS+Nar組TNF-α、IL-1β表達降低(均P<0.05)(見表2)。

表2 各組小鼠肺組織TNF-α、IL-1β表達水平

五、Nar對ALI小鼠肺組織p-SGK1、α-ENaC、Na+-K+-ATPase α1蛋白表達水平的影響

與Control組相比，LPS組肺組織p-SGK1、α-ENaC、Na+-K+-ATPase α1蛋白表達降低(均P<0.05)；與LPS組相比，LPS+Nar組p-SGK1、α-ENaC、Na+-K+-ATPase α1蛋白表達升高(均P<0.05)(見圖2、表3)。

圖2 各組小鼠肺組織p-SGK1、α-ENaC、Na+-K+-ATPase α1蛋白表達水平

表3 各組小鼠肺組織p-SGK1、α-ENaC、Na+-K+-ATPase α1蛋白表達水平

討 論

柚皮苷及其苷元柚皮素作為一種天然的植物化合物，前期的研究表明具有顯著的鎮咳、祛痰、抗肺部炎癥等作用，已被研制成國家一類新藥，在臨床中的應用逐步增加[10]。Chen等[11]人表明柚皮素通過抑制氧化應激和肺部炎癥對百草枯誘導的急性肺損傷和肺纖維化具有治療作用。Lin等[12]發現柚皮素通過抑制自噬，對肺炎支原體感染后的氣道重塑有改善。但柚皮素通過SGK1信號通路改善脂多糖誘導ALI的相關報道較少。本實驗采用脂多糖氣管滴入構建ALI小鼠模型，并運用此模型探究柚皮素對ALI的保護作用及可能的機制。HE染色結果顯示LPS組炎癥細胞浸潤、肺泡上皮壞死脫落、肺泡壁塌陷、間隔增寬、肺泡腔內可見紅細胞，W/D值及TNF-α、IL-1β升高，PaO2降低、OI小于300，說明脂多糖誘導ALI小鼠模型制備成功。

ALI是由于各種因素如細菌感染、敗血癥、嚴重創傷導致的肺部過度炎癥反應，引起肺泡-毛細血管屏障受損和通透性增加[3]。炎癥在ALI期間起著核心作用，促炎因子與抗炎因子的比例失衡是ALI發生的重要一環。TNF-α、IL-1β是由炎癥細胞分泌的促炎因子，在啟動早期炎癥反應和維持炎癥方面起關鍵作用[13]，可調控炎癥的嚴重程度和持續時間，促使中性粒細胞聚集、激活，通過“瀑布式反應”導致嚴重的肺部損害[14-15]。既往研究表明，柚皮素能改善脂多糖誘導的ALI小鼠肺部炎癥[16]。本研究結果顯示LPS組肺組織損傷嚴重，TNF-α、IL-1β表達水平較Control組增加。與LPS組相比，柚皮素預給藥能減輕肺組織損傷、下調TNF-α、IL-1β表達，說明柚皮素在一定程度上可減輕ALI小鼠肺部炎癥，與之前的研究結果相符合。

目前ALI暫無特異性治療藥物，肺保護性機械通氣仍是主流的治療方法，盡管能改善部分患者的預后，但病死率仍居高不下[17]。有研究報道減輕肺水腫是促進患者預后和降低病死率的重要措施。ENaC被認為是肺水腫液清除的中心環節，和位于基底外側的Na+-K+-ATPase協同將Na+從肺泡腔轉運到間質或毛細血管中，兩者共同維持著肺部微環境的穩定[18]。ENaC是一種非電壓依賴性的離子通道，是上皮細胞主要的Na+轉運通道之一，屬于ENaC/退化蛋白家族，主要分布于人體肺部、腎臟、結腸、生殖道及中樞神經系統[19]。肺組織ENaC由位于肺泡上皮細胞頂端的三個亞單位(αβγ)組成，α亞基是ENaC的功能性亞單位[2]。有研究報道缺乏α-ENaC的大鼠在出生后死亡率增加了四倍[20]。由此推測α-ENaC可能是治療ALI的優選靶點。Na+-K+-ATPase由α和β兩個亞單位組成，目前已發現四種Na+-K+-ATPase α單位亞型(α1-α4)[21]。在肺內α1亞單位在肺泡I和Ⅱ型上皮細胞中均有表達[6]。亦有研究發現在急性缺氧條件下，α1亞單位磷酸化會觸發Na+-K+-ATPase內吞作用使其活性降低[22]。α1可能是維持Na+-K+-ATPase活性的重要組成部分，本實驗選擇Na+-K+-ATPase α1為檢測指標。

SGK1最初是在乳腺腫瘤細胞系中發現，屬于Ser/Thr蛋白激酶，有SGK2和SGK3兩種同源體，參與離子轉運、自噬和增殖等[23]。SGK1受磷酸化/去磷酸化調節，磷酸化的SGK1(p-SGK1)是其活性形式。研究發現神經前體細胞表達的發育下調基因4(Nedd-4)可使α-ENaC泛素化從而降低α-ENaC活性，SGK1通過阻斷Nedd-4對α-ENaC的泛素化作用，保留了α-ENaC的功能和活性，增強對Na+的主動轉運能力[24]。SGK1還可直接磷酸化α-ENaC絲氨酸殘基從而增強其轉運Na+的能力和活性[25]。以上研究表明SGK1可能是促進α-ENaC蛋白表達，減輕肺水腫的重要信號途徑之一。為了進一步探究柚皮素是否能通過調控SGK1信號通路起到肺部保護作用，本實驗檢測了各組小鼠肺組織α-ENaC、Na+-K+-ATPase α1蛋白表達水平。結果顯示LPS組肺組織α-ENaC、Na+-K+-ATPase α1蛋白表達較Control組降低，經柚皮素干預后，α-ENaC、Na+-K+-ATPase α1蛋白表達較LPS組增加。同時，本研究還發現LPS組肺組織p-SGK1蛋白表達較Control組降低，柚皮素處理后其表達水平較LPS組增加。以上結果提示柚皮素可能通過激活SGK1，促使α-ENaC、Na+-K+-ATPase α1蛋白表達增加，進而減輕肺組織水腫。

綜上所述，柚皮素通過抑制炎癥介質的釋放及上調α-ENaC、Na+-K+-ATPase α1蛋白表達對脂多糖誘導的ALI小鼠具有保護作用，其機制可能與激活SGK1信號通路有關，但關于柚皮素激活SGK1的確切機制有待更深入的研究。