氧化苦參堿對肺部真菌感染小鼠的病情改善及免疫功能的影響

邊紅芝 韓俊壘 胡建平

肺部真菌感染是常見呼吸系統感染疾病之一，其中煙曲霉菌作為一種機會致病菌，隨著器官、細胞移植及免疫抑制劑、抗菌藥物等應用，引起免疫功能受損人群增多，致使煙曲霉感染逐年增加，而90%以上人群為肺部感染[1]，引起肺功能受損、肺纖維化等，危害患者健康。目前臨床以伏立康唑、泊沙康唑等抗真菌藥治療，效果肯定，但隨著曲霉菌對抗真菌藥物敏感性不斷降低[2]，曲霉菌唑類耐藥已成為全球問題[3]，對治療方法及臨床結局均提出新挑戰。氧化苦參堿(Oxymatrine，OMT)提取自中藥苦參根，是生物堿類化合物，據目前研究發現其具有抑制炎癥、抗腫瘤、抗病毒、免疫保護等多種生物活性[4-5]。另有研究發現[6]，苦參堿對大鼠銅綠假單胞菌感染肺組織Th1/Th2機制具有調節作用，可減輕大鼠肺組織感染損傷。但關于OMT在肺部真菌感染中的應用機制及效果尚無明確報道，本研究通過構建肺部真菌感染小鼠模型，探討OMT對肺部真菌感染的免疫調節機制與應用價值，為臨床相關藥物研發提供實驗依據，報告如下。

資料與方法

一、實驗儀器與材料

OMT購自上海麥克林生化科技有限公司(產品編號：A800927，Purity：98%)，伏立康唑(國藥準字H20052296，深圳市海濱制藥有限公司)、阿莫西林(國藥準字H20083613，四川制藥制劑有限公司)、環磷酰胺(H20160468，Baxter Oncology GmbH)；蘇木精伊紅染色液購自北京華夏遠洋科技有限公司，細胞固定/破膜試劑盒購自上海澤葉生物科技有限公司，PBS溶液、沙保羅瓊脂斜面培養基購自上海信帆生物科技有限公司，蔡氏固體培養基、RPMI-1640培養基購自Sigma-Aldrich(上海)貿易有限公司；CD3、CD4抗體購自上海邁瑞爾化學技術有限公司，干擾素-γ(Interferon-gamma，IFN-γ)、白介素-4(Interleukin-4，IL-4)、白介素-17A(Interleukin-17A，IL-17A)ELISA試劑盒購自Abcam公司；加拿大SCIREQ Flexivent動物肺功能儀購自上海賽睿克生物技術有限公司，流式細胞儀(型號：FACSCalibur，廠家：美國BD公司)，酶標儀(型號：Varioskan LUX，賽默飛世爾科技有限公司)。

二、實驗動物

balb/c清潔級小鼠75只，8周齡，體重20～28 g，購自河南省疾病預防控制中心，許可證號：SYXK(豫)2017-0009，購入后保持環境相對濕度50%～70%，溫度22～26 ℃，明暗交替(12 h制)，自由進食飲水，予以適應性喂養1周，所有操作遵循《實驗動物保護條例》。

三、方法

1.肺部真菌感染小鼠模型[7]

構建免疫抑制小鼠模型，滴鼻前4 d腹腔注射環磷酰胺200 mg·kg-1·d-1，發現小鼠食欲減退，毛發欠光滑，體重稍下降，然后采用煙曲霉菌孢子懸液感染法建立肺部真菌感染小鼠模型，(1)制備煙曲霉菌孢子懸液，①取我院煙曲霉菌感染者菌株，經鏡下證實為煙曲霉，采用針刺及滑動法接種菌株于沙保羅瓊脂培養基上，置于孵箱培養(37 ℃，72 h)，72 h后培養基可見煙綠色霉菌菌落；②采用10 mL PBS溶液(含0.1%吐溫80)沖洗培養基，沖洗液倒入50 mL離心管(管口覆蓋8層無菌紗布)，過濾菌絲，再使用PBS溶液沖洗1次；③將過濾所得孢子懸液置于載玻片上，觀察可見大量孢子；將孢子懸液轉入15 mL離心管離心(500 g，15 min)，去上清液，PBS重懸；④血細胞計數板測定孢子濃度，調整濃度108個/mL，4 ℃保存；⑤將制備的孢子懸液定比(1∶10)稀釋，確定孢子活力與濃度(107個/mL)。(2)接種煙曲霉菌，取1000 mL容量燒杯，底部墊棉花，燒杯倒入適量乙醚，放置小鼠于燒杯內，蓋上硬紙，約15～20 s后小鼠由興奮轉入抑制狀態，取出小鼠，保持直立狀，堵住口部，移液槍吸取50 μl煙曲霉菌孢子懸液，從小鼠鼻孔慢慢滴入，滴鼻后保持小鼠直立約10 min，保證小鼠能充分吸入，使小鼠被動感染，小鼠蘇醒后無菌籠中自由取食，觀察小鼠精神、進食、存活狀態，滴鼻后第0天、4天、7天取眼眶學檢測中性粒細胞，較正常參考值減少，有炎癥發生，證實已初步構建感染模型。

2.氧化苦參堿溶液制備

10 mg氧化苦參堿溶于10 μl甲醇，完全溶解可配成1000 mg/mL母液，稀釋成低濃度250 μg/mL、高濃度1000 μg/mL，用于后續實驗。

3.分組與干預方法

將75只小鼠適應性喂養1周后，取15只作為對照組(鼻孔滴入等量生理鹽水)，其余60只采用煙曲霉菌孢子懸液感染法建立肺部真菌感染小鼠模型，成功造模56只，隨機分為模型組(14只)、OMT低劑量組(14只)、OMT高劑量組(14只)、西藥組(14只)。

造模后第2天各組均予以每日阿莫西林75 mg/kg灌胃以預防細菌感染，其中OMT低劑量組腹腔注射12.5 mg/kg OMT，每日1次，并予以10 μl甲醇灌胃(12 h/次)，給藥2周；OMT高劑量組腹腔注射50 mg/kg OMT，每日1次，并予以10 μl甲醇灌胃(12 h/次)，給藥2周；西藥組首日予以伏立康唑負荷劑量60 mg/kg，之后每日以30 mg/kg進行維持，給藥方式為灌胃，均為12 h/次，并予以10 μl甲醇腹腔注射(1次/d)，給藥2周；模型組與對照組予以等量生理鹽水灌胃與腹腔注射，干預2周。

4.動物肺功能儀測定各組小鼠肺功能水平

末次干預2 h后，使用40 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉各組小鼠，切開氣管，置入氣管插管，固定插管，放置小鼠于動物肺功能儀箱，連接管道裝置，設置通氣參數，記錄各組小鼠最高呼氣流速(Peak expiratory flow，PEF)、0.1秒用力呼氣容積(Forced expiratory volum in 0.1 second，FEV 0.1)及0.2秒用力呼氣容積(Forced expiratory volum in 0.2 second，FEV 0.2)值。

5.肺組織真菌負荷測定

完成肺功能測定后脫頸處死小鼠，無菌條件下取出肺臟、脾臟，部分肺組織按1：10質量體積比(生理鹽水稀釋)制備肺組織勻漿，選擇100、10-1、10-2稀釋度計數，將不同濃度1 mL稀釋液接種于蔡氏固體培養基上，每個濃度3塊平皿，置于26.5 ℃培養箱中培養4 d左右，計算孢子數/mL=(各稀釋度3個平皿菌落平均數×稀釋倍數之和)/3。

6.HE染色觀察小鼠肺組織形態學變化

① 取剩余小鼠肺組織，4%多聚甲醛固定肺組織24 h，流動水沖洗肺組織4 h，梯度酒精(75%乙醇過夜，85%乙醇I、85%乙醇Ⅱ、95%乙醇I、95%乙醇Ⅱ各1.5 h，100%乙醇I、100%乙醇Ⅱ各1 h)脫水，脫水后將肺組織置于二甲苯+乙醇混合液、二甲苯I、二甲苯Ⅱ中，各30 min，透明后組織采用純石蠟包埋，切片機切片，每片厚度5 μm，溫水皿展開薄片，置于43 ℃水中，貼至載玻片，烘烤4 h；②取出烘烤后切片，置于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中，各20 min，之后梯度酒精浸洗(100%、95%、90%、80%、70%，5 min/次)，切片入水浸洗；③將切片置于蘇木素染液5 min，蒸餾水沖洗5 min，鹽酸酒精3 s，自來水沖洗20 min，蒸餾水浸泡2 min，置入伊紅染液，約3 min；④脫水、透明、封片，將切片浸入酒精(75%、85%、95%，各2 min)、無水乙醇Ⅰ(5 min)、無水乙醇Ⅱ(5 min)、二甲苯Ⅰ(10 min)、二甲苯Ⅱ(10 min)，取出后滴加樹膠，室溫晾干，顯微鏡下觀察染色，200×鏡下拍照。

7.ELISA法測定肺組織炎癥因子

取少量肺組織，將肺組織與生理鹽水以1∶10質量體積比制作勻漿，取10%肺組織勻漿使用離心機離心(3000 r/min，15 min)，取上清液，分三等份，-80 ℃保存，ELISA法檢測，步驟如下：室溫下解凍，設置標準品孔、樣本孔，樣本孔加樣本10 μl，再加樣本稀釋液40 μl，空白孔不加，標準品孔、樣本孔中每孔加入HRP標記抗體100 μl，封板膜封住反應孔，恒溫箱溫育60 min，棄去液體，拍干，每孔加洗滌液，靜置1 min，棄去洗滌液，拍干，重復洗板5次，每孔加入底物，37 ℃避光孵育15 min，每孔加終止液50 μl，15 min內450 nm波長處酶標儀測定各孔OD值，通過標準曲線計算各組小鼠肺組織IFN-γ、IL-4、IL-17A水平。

8.流式細胞儀測定小鼠脾臟Th細胞變化

各組小鼠脫頸處死后取脾臟70 μm，篩網上加淋巴細胞分離液，進行研磨，將研磨液轉入15 mL離心管，覆蓋500 μl RPMI-1640培養基，液面分界；室溫下離心(800g，30 min)，吸出淋巴細胞分離層，10 mL RPMI-1640 培養基洗滌，再次離心(條件同上)，丟棄上清液，重懸細胞，加入CD4抗體，孵育30 min；之后加入細胞固定破膜液(4 ℃，避光30 min)，離心(400 g，5 min)，棄上清，PBS重懸細胞，加入胞內IL-4、IFN-γ、IL-17A抗體，孵育(室溫，30 min)后離心(400 g，5 min)，洗去多余抗體，棄上清后重懸細胞，流式細胞儀測定Th1、Th2、Th17細胞。

四、統計學方法

結 果

一、肺功能比較

五組小鼠PEF、FEV 0.1、FEV 0.2水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)；模型組、OMT低劑量組、OMT高劑量組、西藥組小鼠PEF、FEV 0.1、FEV 0.2水平均低于對照組(P<0.05)；OMT低劑量組、OMT高劑量組、西藥組小鼠PEF、FEV 0.1、FEV 0.2水平高于模型組(P<0.05)；OMT高劑量組、西藥組小鼠PEF、FEV 0.1、FEV 0.2水平高于OMT低劑量組(P<0.05)；OMT高劑量組、西藥組兩組小鼠PEF、FEV 0.1、FEV 0.2水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)(見表1)。

表1 各組小鼠肺功能水平比較

二、肺組織煙曲霉菌負荷比較

四組小鼠肺組織煙曲霉菌負荷比較，差異有統計學意義(P<0.05)；OMT低劑量組、OMT高劑量組、西藥組小鼠肺組織煙曲霉菌負荷均明顯低于模型組(P<0.05)；OMT高劑量組、西藥組小鼠肺組織煙曲霉菌負荷低于OMT低劑量組(P<0.05)；OMT高劑量組、西藥組兩組小鼠肺組織煙曲霉菌負荷比較，差異無統計學意義(P>0.05)(見表2)。

表2 干預后各組小鼠肺組織煙曲霉菌負荷比較個/CFU)

三、肺組織形態學變化

各組小鼠HE染色發現，對照組小鼠肺組織結構完整，細胞排列整齊，未見炎性細胞浸潤；模型組小鼠肺組織細胞排列紊亂，支氣管管壁周圍有明顯炎性細胞浸潤，肺泡內有大量中性粒細胞浸潤；OMT低劑量組、OMT高劑量組、西藥組小鼠肺組織均有不同程度炎性細胞浸潤減少，且MT高劑量組與西藥組炎性浸潤明顯減輕(見圖1)。

圖1 HE染色觀察各組小鼠肺組織形態學變化(×200，A：對照組；B：模型組；C：OMT低劑量組；D：OMT高劑量組；E：西藥組)

四、肺組織炎癥因子水平比較

五組小鼠肺組織IL-4、IL-17A、IFN-γ比較，差異有統計學意義(P<0.05)；模型組、OMT低劑量組、OMT高劑量組、西藥組，小鼠肺組織IL-4、IL-17A水平均高于對照組，肺組織IFN-γ水平低于對照組(P<0.05)；OMT低劑量組、OMT高劑量組、西藥組，小鼠肺組織IL-4、IL-17A水平低于模型組，肺組織IFN-γ水平高于模型組(P<0.05)；OMT高劑量組、西藥組，小鼠肺組織IL-4、IL-17A水平低于OMT低劑量組，肺組織IFN-γ水平高于OMT低劑量組(P<0.05)；OMT高劑量組、西藥組，兩組小鼠肺組織IL-4、IL-17A、IFN-γ水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)(見表3)。

表3 各組小鼠肺組織炎癥因子水平比較

五、脾臟Th細胞水平

五組小鼠脾臟Th1、Th2、Th17比較，差異有統計學意義(P<0.05)；模型組、OMT低劑量組、OMT高劑量組、西藥組小鼠脾臟Th2、Th17細胞水平高于對照組，脾臟Th1細胞水平低于對照組(P<0.05)；OMT低劑量組、OMT高劑量組、西藥組小鼠脾臟Th2、Th17細胞水平低于模型組，脾臟Th1細胞水平高于模型組(P<0.05)；OMT高劑量組、西藥組小鼠脾臟Th2、Th17細胞水平低于OMT低劑量組，脾臟Th1細胞水平高于OMT低劑量組(P<0.05)；OMT高劑量組、西藥組兩組小鼠肺組織脾臟Th2、Th17、Th1細胞水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)(見表4)。

表4 各組小鼠脾臟TH細胞比較

討 論

由煙曲霉菌引起的肺部真菌感染，近年病例數呈增加趨勢，且病變進展時可出現嚴重肺炎、呼吸衰竭等癥狀，增加臨床危險性，目前研究發現炎癥因子與免疫功能，在肺部感染病變中起重要作用，患者免疫功能低下，炎癥因子浸潤肺組織增強[8-9]，而臨床抗真菌藥物耐藥問題突出[10]，更易造成患者死亡，故而明確機制、探尋有效治療方法十分必要。

隨著近年中藥醫學發展，發現部分中藥提取物具有抗真菌作用，其有效成分在干擾物質運輸、宿主免疫、氧化還原方面有特異效用[11]。苦參屬于清熱解毒類中藥，有學者發現[12]其有效提取物OMT，具有抗纖維化作用；有研究表明[13]苦參堿具有抑菌活性，且抑菌濃度存在量效關系；另有研究發現[14]OMT可通過免疫調節保護小鼠免疫性肝損傷，說明OMT具有廣泛可靠的藥理價值。本研究構建肺部煙曲霉菌感染模型后發現，模型組肺組織煙曲霉菌負荷明顯提高，HE染色發現肺組織細胞排列紊亂，存在明顯炎性細胞浸潤，ELISA法測定肺組織IL-4、IL-17A水平升高，肺組織IFN-γ水平降低，且肺功能PEF、FEV 0.1、FEV 0.2水平明顯下降，說明煙曲霉菌感染后小鼠肺部炎癥反應增強，導致肺功能降低；予以對應干預后發現，OMT低劑量組、OMT高劑量組、西藥組，小鼠肺組織煙曲霉菌負荷降低，炎癥反應減輕，肺功能有不同程度改善，說明OMT可發揮抗炎作用、激活吞噬功能，與對應西藥，均對肺部煙曲霉菌感染有一定作用；且本研究發現OMT具有劑量依賴性，OMT高劑量組炎癥減輕及肺功能改善程度均優于OMT低劑量組，且與西藥組無明顯差異，表明提高OMT劑量可降低肺組織煙曲霉菌負荷，增加抗真菌效果，以減輕炎性浸潤，促進小鼠肺功能改善。

張明發等[15]學者研究表示，苦參生物堿具有免疫促進作用。另有研究證實[16]，OMT可通過調節Treg與Th17細胞失衡，對類風濕性關節炎大鼠，發揮抗炎作用。而本研究小鼠肺組織IFN-γ、IL-4、IL-17A變化明顯，而Th1細胞主要分泌IFN-γ細胞因子，Th2細胞主要分泌IL-4細胞因子，IL-17A由Th17細胞分泌，為進一步明確產生炎癥因子的細胞變化機制，本研究觀察Th1、Th2、Th17細胞變化情況，結果發現，模型組小鼠脾臟Th2及Th17細胞水平升高，脾臟Th1細胞水平降低，而使用伏立康唑與不同劑量OMT干預后，脾臟Th2、Th17細胞水平均得到不同程度降低，脾臟Th1細胞水平均升高，且相較于低劑量OMT，高劑量OMT與伏立康唑更利于小鼠機體TH細胞調節，說明高劑量OMT可達到西藥伏立康唑相似效果，提示OMT能改變Th細胞極化，協調Th1、Th2、Th17細胞間水平，通過上調Th1與下調Th2細胞，來增強吞噬細胞活性，抑制Th17細胞水平以減輕炎癥浸潤，整體增加小鼠抗真菌能力。

綜上，OMT可降低肺部真菌感染小鼠肺組織真菌負荷，減輕肺組織炎性浸潤，改善肺組織病理狀態，進而促進小鼠肺功能改善，可能與協調TH細胞免疫反應來提高OMT抗真菌能力有關，為臨床OMT相關藥物研發提供理論支持。