TPX2對非小細胞肺癌細胞增殖、凋亡的調控能力及作用機制研究

孫靜 張峰

目前，肺癌在我國占城市人口惡性腫瘤死亡原因第一位。肺癌是臨床最為常見的呼吸系統惡性腫瘤，具有高發病率、高死亡的特點[1]。肺癌主要特點為早期轉移、生長迅速、高度侵襲性。但Ⅰ期肺癌術后10年生存率可高達90%左右。肺癌包括很多種類，其中最為常見的是非小細胞肺癌，大約占所有肺癌患者的80%左右，其早期癥狀為發熱、咳嗽、胸疼等[2,3]。臨床較為常用的治療非小細胞肺癌的手段包括放療、化療、外科手術等，但臨床療效均不十分理想。TPX2蛋白在癌組織中呈現異常高表達，與癌組織的發展、轉移具有密切聯系[4-6]。本文研究中調控TPX2蛋白表達，旨在探究TPX2對非小細胞肺癌細胞增殖、凋亡的調控能力及相關作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人非小細胞肺癌細胞株，購于上海中國科學院細胞庫。主要試劑：兔抗大鼠Bak抗體(Invitrogen公司)；大鼠抗小鼠Bcl-2抗體(Dako公司)；兔抗小鼠caspase7抗體(Selleck公司)；抗體TPX2(biolegend公司產品)；BCA蛋白定量試劑盒、蘇木素(廣州市潔利生物有限公司)；MTT試劑盒(天根生化科技有限公司)；DAB顯色試劑、磷酸鹽緩沖液、胎牛血清、DMSO(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及分組:將非小細胞肺癌細胞株在37℃進行培養，在5%二氧化碳CO2飽和濕度細胞培養箱中，細胞培養液為10%胎牛血清。當細胞融入85%左右時進行傳代。

1.2.2 TPX2相對表達量檢測:免疫組化采用SP法。TPX2上調序列：5’-ACCTTGCCCTACTAAGATT- 3’；TPX2下調序列：5’-AATGTGGCACAGGTTGAGC-3’。待檢組織10%甲醛溶液固定，常規石蠟包埋，切片，二甲苯脫蠟處理。分別使用100%～70%的梯度乙醇水化，檸檬酸鹽高溫、高壓修復抗原。等待降至室溫后孵育濃度為1∶100的一抗過夜。次日使用PBST洗滌3次，孵育二抗(通用型)DAB顯色，蘇木素復染，顯微鏡下進行觀察分為對照組、下調TPX2組合上調TPX2組。重懸處理后分別加入4 μg 0.9%氯化鈉溶液、TPX2siRNA、pcDNA3.1-TPX2，電擊處理后室溫環境下存放120 min，將各組細胞加入6孔、96孔培養板中，置于培養箱內進行培養取出后加入含800 μg/ml G418的培養基再次培養。

1.2.3 細胞增殖:使用MMT檢測方法進行檢測。將待檢細胞接種到96孔板中，每孔板中加入3 000個細胞，100 μl細胞培養液，每組設置5個重復孔，進行孵育48 h。在每孔中添加MTT溶液20 μl，置于37℃、5%CO2培養箱中反應4 h，將孔中的液體吸除干凈，每孔中在添加150 μl的二甲基亞砜(DMSO)溶液，孵育振蕩反應10 min，用全自動酶標儀檢測492 nm處OD值。3次重復實驗，取其平均值。

1.2.4 細胞凋亡:使用流式細胞儀進行檢測。將待測細胞用磷酸鹽緩沖液洗2次，加入5 μl的AnnexinV染液和10 μl的碘化丙啶染液，4℃避光染色30 min，使用流式細胞儀檢測凋亡率。

1.2.5 細胞周期分布:用流式細胞儀檢測。將培養好的細胞用70%的乙醇溶液固定，4℃保存過夜，離心5 min去除固定液后，使用磷酸鹽緩沖液清洗3次。加入濃度為100 μg/ml的RNA酶100 μl，常溫保存30 min，加入100 μl碘化丙啶染色液，低溫避光染色30 min，使用流式細胞儀檢測細胞周期分布。

1.2.6 細胞凋亡相關蛋白:使用Western blot法檢測，轉染48 h后提取蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。與緩沖液混合100℃煮沸5 min后電泳。在90 V、4℃下靶蛋白轉移至NC膜上，轉膜時間為90 min，封閉：5%胎牛血清白蛋白，室溫孵育60 min。經NC膜放置在1∶900稀釋一抗中4℃進行孵育。二抗室溫1 h后顯色。對細胞凋亡相關蛋白Bak、Bcl-2、caspase3相對表達量進行檢測。

2 結果

2.1 3組非小細胞肺癌細胞中TPX2表達 下調TPX2組A549的表達含量高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。上調TPX2組A549表達量低于對照組、下調TPX2組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組非小細胞肺癌細胞中TPX2表達

2.2 3組非小細胞肺癌細胞增殖率比較 下調TPX2組細胞增殖率高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；上調TPX2組細胞增殖率低于對照組、下調TPX2組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組非小細胞肺癌增殖率比較

2.3 3組非小細胞肺癌細胞周期分布情況比較 下調TPX2組細胞處于G1期的比例高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；上調TPX2組細胞處于G1期的比例低于對照組、下調TPX2組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 3組非小細胞肺癌細胞周期分布情況比較

2.4 3組非小細胞肺癌細胞凋亡率比較 下調TPX2組細胞凋亡率低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；上調TPX2組細胞凋亡率高于對照組、下調

TPX2 組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 3組非小細胞肺癌細胞凋亡率比較

2.5 3組細胞凋亡相關蛋白Bak、Bcl-2、caspase3相對表達量比較 下調TPX2組細胞Bcl-2、caspase3蛋白相對表達量高于對照組，Bak蛋白相對表達量低于對照組、下調TPX2，Bak蛋白相對表達量高于對照組、下調TPX2組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表5，圖1。

表5 3組細胞凋亡相關蛋白Bak、Bcl-2、caspase3相對表達量比較

圖1 Bak、Bcl-2、caspase3表達WB圖；A 對照組；B 下調TPX2組；C 上調TPX2組

3 討論

近年來，我國肺癌的發病率及死亡率呈逐年上升趨勢，嚴重威脅人類生命健康的常見惡性腫瘤之一。其中非小細胞肺癌在肺癌中占比80%左右，5年內的生存率僅在10%左右。非小細胞肺癌(NSCLC)是一種上皮組織來源的惡性腫瘤[7,8]。主要包括腺癌、鱗癌、大細胞癌、因其生長分裂及擴散轉移相對較晚，發病機制不夠明確，確診時患者一般處于中晚期。EGRF絡氨酸激酶抑制藥的出現使分子靶向治療進入人們的視野，為非小細胞肺癌的個體化治療注入了新的生命[9]。各類靶向藥物的研究層出不窮，尋找有效地治療靶點對非小細胞肺癌患者來說至關重要。研究發現，TPX2基因在多種惡性腫瘤中存在高表達[10]。具有組織特異性。通過下調AKT信號通路活性可以阻止TPX2基因的表達。TPX2作為新發現的癌基因，可以稱為腫瘤細胞增殖更加確切的指標[11]。

1998年首次在非洲有爪蟾蜍中發現，因Xklp2靶蛋白得名。對相關癌指標具有調控作用。參與多種惡性腫瘤的發生發展。在G1/S期過渡到胞質分裂時顯著表達，在有絲分裂S/G2期存在細胞核，在腫瘤中AuroraA是一類絲氨酸/蘇氨酸激酶，屬于Aurora激酶家族，與調節中心體及微管功能相關。在細胞的蛋白表達水平中TPX2與Aurora激酶家族具有相似性。其在神經膠質瘤中，表達水平隨著腫瘤級別的升高而增加[13,14]。研究發現，TPX2與腫瘤的發生存在密切關系，TPX2基因的表達與AKT信號通路的活性下調有關，在食道癌、胃癌等多種腫瘤中出現高表達，汪博等[15]在研究中表示，TPX2在紡錘體聚集及著絲點微管形成有重要作用。說明TPX2可能作為一個癌基因影響腫瘤的發生發展。本文研究結果顯示，下調TPX2組非小細胞肺癌細胞TPX2表達量相對較低，下調TPX2可以降低非小細胞肺癌細胞的相對表達量。

細胞周期分為3個：DNA合成前期(G1)、合成期(S)、合成后期(G2)，S是細胞分裂增殖的重要時期。在S期前將細胞阻滯能夠有效的抑制癌細胞的發展。相關研究顯示，TPX2能夠結合并活化AuroraA，有效地調控A549細胞改變癌細胞的周期分布[16,17]。本文研究結果顯示，下調TPX2組非小細胞肺癌細胞在G1期的比例相對較高，說明下調TPX2能夠降低非小細胞肺癌細胞的相對表達量，起到改變癌細胞周期分布的作用。

細胞的增殖與凋亡是一個復雜的過程，受細胞內多種因子相互作用。Caspase家族蛋白、Bal-2家族蛋白等在凋亡信號中扮演重要角色。Caspase3在其中發揮凋亡執行作用，活化后形成Cleaved Caspase3，標志著細胞凋亡進入不可逆的階段[18]。Bcl-2是Bcl-2家族蛋白中抗凋亡蛋白，其水平在升高后可有效抑制細胞凋亡的發生;Bak是促凋亡蛋白[19]。本文研究顯示，下調TPX2組在12、24、72 h非小細胞肺癌細胞凋亡率升高。且下調TPX2組細胞Bcl-2、Caspase3蛋白相對表達量低，Bak蛋白相對表達量升高，說明下調TPX2能夠抑制非小細胞肺癌細胞表達，通過調控細胞凋亡相關蛋白Bak、Bcl-2、Caspase3相對表達量，起到促進非小細胞肺癌細胞凋亡的作用，達到抑制腫瘤發展的目的。

綜上所述，下調TPX2能夠降低非小細胞肺癌細

胞表達，通過調控Bak、Bcl-2、Caspase3的表達，達到抑制細胞增殖，阻滯細胞周期分布，促進細胞凋亡的目的。治療效果顯著，為臨床靶向治療非小細胞肺癌提供理論依據。