布魯氏菌DnaJ蛋白的表達及功能分析

印雙紅 ， 張俊波 ， 李寅翠 ， 張孟琴 ， 毛 宏 ， 易 萌 ， 蔡春連 ， 張 紅 ， 李志強 ， 陳創夫

(1.銅仁學院大健康學院 ， 貴州 銅仁 554300 ； 2.銅仁學院農林工程與規劃學院 ， 貴州 銅仁 554300 ；3.銅仁學院貴州省梵凈山地區生物多樣性保護與利用重點實驗室 ， 貴州 銅仁 554300 ； 4.銅仁學院材料與化學工程學院 ， 貴州 銅仁 554300 ； 5.商丘師范學院生物與食品學院 ， 河南 商丘 476000 ； 6.石河子大學動物科技學院 ， 新疆 石河子 832000)

布魯氏菌病是一種人獸共患傳染病，布魯氏菌疫苗仍存在安全性差、免疫期短、重復免疫等一些缺陷[1]，現有的亞單位疫苗還未達到減毒活疫苗的保護水平[2]，與減毒活疫苗相比，亞單位疫苗具有避免發生免疫副反應并有助于血清學監測的優點[3]，用于布魯氏菌病亞單位疫苗研制的蛋白主要包括分子伴侶DnaK、外膜蛋白和AsnC等[4-5]，但這些融合蛋白疫苗不能持續誘導有效的細胞免疫反應。

DnaJ是一種具有分子伴侶特性的蛋白質，DnaJ蛋白在生命體細胞中具有活性，功能為糾正或清除細胞內錯誤折疊、損傷失去活性的蛋白質和指導生成正確且具有生物活性的蛋白質，從而保護細胞免受應激破壞[6]。本試驗通過對DnaJ蛋白進行表達與純化，并研究其在細胞和小鼠體內產生的細胞和體液免疫反應，旨在為該蛋白的功能和疫苗開發研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及實驗動物TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、蛋白Marker和DNA Marker,均購自寶生物工程(大連)有限公司；質粒pET-30a，購自Novagen公司；小鼠IFN-γ、IL-4、IgG1和IgG2a ELISA試劑盒，均購自美國GBD公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒，均購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 菌株和細胞 布魯氏菌M5-90、DE3感受態細胞、DH5α感受態細胞和RAW264.7細胞為貴州省梵凈山地區生物多樣性保護與利用重點實驗室保存。

1.3 實驗動物 6周齡體重約17 g的BALB/c小鼠，購自新疆醫科大學動物實驗中心。

1.4 試驗方法

1.4.1 DnaJ蛋白的生物信息學分析 利用Predicting Antigenic Peptides在線預測DnaJ蛋白的抗原決定簇。使用SOPMA在線軟件分析預測DnaJ蛋白的二級結構。

1.4.2DnaJ基因的合成及重組表達質粒pET-30a-DnaJ的構建 在布魯氏菌M5-90株的DnaJ基因序列(BMEI1513)上接上NdeI/Hind III酶切位點，然后送通用生物系統(安徽)有限公司合成基因序列。對pET-30a表達載體進行NdeI/Hind III雙酶切，然后將DnaJ(NdeI/Hind III)目的片段連接至pET-30a載體，連接體系為20 μL：pET-30a 4.0 μL，10×Ligation Buffer 4.0 μL，T4 DNA Ligase 0.3 μL，ddH2O 9.7 μL。22 ℃連接16 h。用試劑盒提取pET-30a-DnaJ質粒，然后對該質粒進行酶切驗證，酶切體系為30 μL：NdeI內切酶1.0 μL，Hind III內切酶1.0 μL，質粒pET-30a-DnaJ 4.0 μL，10×Ligation Buffer 3.0 μL，ddH2O 21.0 μL，然后將質粒送深圳華大基因科技有限公司測序，然后進行DnaJ蛋白表達。

1.4.3 DnaJ蛋白的表達及純化 將PET-30a-DnaJ質粒轉化至DE3感受態細胞中，37 ℃、220 r/min振搖至菌體OD600值為0.6～0.8，向細菌培養物中加入誘導劑IPTG(1 mmol/L)，在37 ℃、220 r/min條件下培養2、4 h和6 h以誘導DnaJ蛋白的表達，用20 μL的PBS重懸菌體并加入20 μL的5×Loading Buffer，利用12%的SDS-PAGE凝膠電泳檢測，凝膠經染色和脫色后檢測DnaJ蛋白的表達情況。將培養好的菌液12 000 r/min離心6 min，加入裂解液Liysis 4 ℃裂解10 h，在液氮和37 ℃水浴鍋中反復凍融3次后，對菌體進行超聲破碎，12 000 r/min離心25 min后收集沉淀，加入8 mol/L尿素，用0.45 μm濾膜過濾，用AKTAxpress智能多維純化系統對DnaJ蛋白純化，收集洗脫液，SDS-PAGE電泳檢測DnaJ蛋白的純化效果。

1.4.4 小鼠巨噬細胞RAW 264.7中的IFN-γ和IL-4檢測 用含10%胎牛血清的培養基在37 ℃、5%CO2條件下培養RAW264.7細胞至對數生長期，試驗組每孔加入25 mg的DnaJ蛋白，對照組添加PBS，在4、12 h和24 h收集細胞上清液，用ELISA試劑盒測定IFN-γ和IL-4的水平，操作方法見試劑盒說明書。

1.4.5 小鼠脾細胞中的IFN-γ和IL-4檢測 選取6周齡的BALB/c小鼠，將正常小鼠斷頸椎處死(每組5只)，無菌取出脾臟，通過勻漿法獲得單細胞懸液，利用ACK紅細胞裂解液除去紅細胞。脾細胞在96孔微量滴定板中以4×105個細胞/孔進行培養；試驗組每孔加入25 mg的DnaJ蛋白，對照組添加PBS。在37 ℃、5%CO2條件下與細胞共同孵育12 h和24 h，收集細胞上清液，用ELISA試劑盒檢測脾細胞分泌的IFN-γ和IL-4水平，操作步驟見試劑盒使用說明書。

1.4.6 小鼠免疫及體液免疫水平檢測 將6周齡的BALB/c小鼠隨機分為試驗組和對照組，20只/組。試驗組小鼠腹腔注射DnaJ蛋白(50 μg/只)，對照組小鼠注射PBS(200 μL/只)，共免疫2次，免疫間隔21 d，首次免疫后的第7、21天和第35天對小鼠斷尾采血分離血清，用ELISA試劑盒測定血清中IgG1和IgG2a水平，操作步驟見試劑盒使用說明書。

1.4.7 DnaJ蛋白免疫小鼠后誘導IFN-γ和IL-4水平分析 取1.4.6中免疫35 d的小鼠，將小鼠斷頸椎處死(每組5只)，無菌取出脾臟，通過勻漿法獲得單細胞懸液，利用ACK紅細胞裂解液除去紅細胞。脾細胞在96孔微量滴定板中以4×105個/孔進行培養；每孔加入25 mg的DnaJ蛋白或熱滅活的布魯氏菌16M裂解液，陽性對照組添加0.5 mg的ConA，陰性對照組添加RPMI 1640細胞培養基，在37 ℃、5%CO2條件下與細胞共同孵育72 h，收集細胞上清液，用ELISA試劑盒測定細胞中IFN-γ和IL-4的水平，操作方法見試劑盒說明書。

2 結果

2.1 DnaJ重組蛋白的生物信息學分析 Predicting Antigenic Peptides預測DnaJ蛋白有11個抗原決定簇，分別在第4～12、21～30、46～53、71～78、149～172、178～188、209～217、227～245、254～262、265～271、285～293位氨基酸處(表1)。SOPMA預測DnaJ蛋白中有68個氨基酸參與形成α-螺旋，占總氨基酸的比例為21.73%；54個氨基酸參與延伸鏈的形成，占總氨基酸的比例為17.25%；21個氨基酸參與β-折疊的形成，占總氨基酸的比例為6.71%；170個氨基酸參與無規卷曲結構的形成，占總氨基酸的比例為54.31%(圖1)。

表1 DnaJ蛋白抗原決定簇的預測Table 1 Prediction of antigen clusters in DnaJ protein

圖1 DnaJ蛋白二級結構的預測Fig.1 Prediction of secondary structure in DnaJ protein

2.2 重組表達質粒pET-30a-DnaJ的構建及鑒定 對重組載體pET-30a-DnaJ進行NdeI/Hind III雙酶切，得到942 bp的條帶，與理論值相符(圖2)，同時測序結果與GenBank中一致，表明重組質粒pET-30a-DnaJ構建成功。

圖2 重組質粒pET-30a-DnaJ的構建及鑒定Fig. 2 Construction and verification of recombinant plasmid pET-30a-DnaJM:DNA marker 4 500; 1:pET-30a-DnaJ的酶切產物; 2:pET-30a-DnaJ質粒M:DNA marker 4 500; 1:pET-30a-DnaJ digestion product;2:pET-30a-DnaJ plasmid

2.3 DnaJ蛋白的表達及純化 表達結果顯示，得到與預期蛋白質分子質量大小一致的37.7 kDa DnaJ蛋白(圖3A)。純化結果顯示，DnaJ蛋白的純化效果較好(圖3B)。

圖3 融合蛋白DnaJ的表達鑒定(A)及純化(B)Fig. 3 Expression,identification (A) and purification (B) of fusion protein DnaJM:蛋白分子marker; 1:IPTG誘導2 h的pET-30a-DnaJ; 2:IPTG誘導4 h的pET-30a-DnaJ; 3:IPTG誘導6 h的pET-30a-DnaJ; 4:DE3; 5:未純化蛋白; 6:純化蛋白M:Protein molecule marker; 1:Induced pET-30a-DnaJ for 2 h by IPTG; 2:Induced pET-30a-DnaJ for 4 h by IPTG; 3:Induced pET-30a-DnaJ for 6 h by IPTG; 4:DE3; 5:Unpurified protein; 6:Purified protein

2.4 DnaJ蛋白誘導RAW 264.7細胞產生IFN-γ和IL-4 結果如圖4所示，在4 h時，DnaJ蛋白刺激RAW 264.7細胞中的IFN-γ水平顯著高于PBS對照組(P<0.05)，而IL-4水平無明顯變化(P>0.05)；在12 h和24 h時，DnaJ蛋白刺激RAW 264.7細胞中的IFN-γ和IL-4水平均極顯著高于PBS對照組(P<0.01)。結果表明，DnaJ蛋白可誘導RAW 264.7細胞產生IFN-γ和IL-4。

圖4 DnaJ融合蛋白誘導RAW 264.7細胞產生的IFN-γ和IL-4水平變化Fig.4 The levels of IFN-γ and IL-4 cytokine production in RAW 264.7 cells after induction with DnaJ fusion protein與PBS對照組相比，*：P<0.05，**：P<0.01； 下圖同Compare to group PBS, *：P<0.05，**：P<0.01. The same as below

2.5 DnaJ蛋白誘導小鼠脾細胞產生IFN-γ和IL-4 結果如圖5所示，在12 h和24 h時，DnaJ蛋白刺激小鼠脾細胞產生的IFN-γ和IL-4水平均極顯著高于對照組(P<0.01)。結果表明，DnaJ蛋白可誘導小鼠脾細胞產生Th1和Th2型免疫反應。

圖5 DnaJ融合蛋白誘導小鼠脾細胞產生的IFN-γ和IL-4水平變化Fig.5 The levels of IFN-γ and IL-4 production in mouse splenocytes after induction with DnaJ fusion protein

2.6 DnaJ蛋白可誘導細胞免疫反應 結果如圖6所示，免疫DnaJ蛋白的小鼠脾細胞產生的IFN-γ和IL-4水平均極顯著高于免疫PBS的小鼠(P<0.01)；ConA可誘導小鼠脾細胞產生高水平的IFN-γ和IL-4；而RPMI 1640和免疫PBS不能誘導小鼠脾細胞產生IFN-γ和IL-4。結果表明，DnaJ蛋白可誘導小鼠產生Th1和Th2型免疫反應。

圖6 DnaJ融合蛋白誘導的細胞免疫反應變化Fig. 6 Changes in cellular immune response induction with DnaJ fusion protein

2.7 DnaJ蛋白可誘導體液免疫反應 結果如圖7所示，在7 d時，免疫DnaJ蛋白的小鼠產生的IgG1和IgG2a與PBS對照組相比無明顯變化(P>0.05)；在21 d和35 d時，免疫DnaJ蛋白的小鼠產生的IgG1和IgG2a水平極顯著高于PBS對照組(P<0.01)。結果表明，DnaJ蛋白免疫小鼠可誘導機體產生IgG1和IgG2a的體液免疫反應。

圖7 DnaJ融合蛋白誘導的體液免疫反應變化Fig. 7 Changes in humoral immune response induction with DnaJ fusion protein

3 討論

Th1型免疫反應的主要特性是產生IFN-γ，以抵抗布魯氏菌的感染[7]。巨噬細胞在布魯氏菌感染過程中可分泌大量IFN-γ以殺死胞內的細菌[8]。IL-4由Th2型細胞產生，可介導細胞免疫應答，誘導Th2細胞的生長和分化[9]。IgG1抗體的產生依賴于Th2型細胞因子IL-4的分泌，而IgG2a抗體的產生依賴于Th1型細胞因子IFN-γ的分泌[10]。本試驗發現，DnaJ融合蛋白可刺激小鼠巨噬細胞、脾細胞及小鼠體內均產生高水平的IFN-γ和IL-4，且在小鼠體內誘導高水平的IgG1和IgG2a抗體，表明DnaJ蛋白可誘導小鼠體外細胞和體內產生Th1和Th2型免疫反應，且Th1和Th2型免疫反應進一步促進了IgG1和IgG2a抗體產生，增加了小鼠的體液免疫。

DnaJ是刺激DnaK的ATP酶和蛋白折疊活性的輔助分子伴侶[11]。DnaJ作為毒力因子參與一些細菌的致病過程，影響細菌感染宿主細胞[12-13]。黏膜免疫的DnaJ蛋白可誘導細胞產生抗體、IL-10、IFN-γ和IL-17A，通過腹膜內接種DnaJ后誘導小鼠IgG滴度和淋巴細胞增殖；黏膜免疫接種DnaJ蛋白能夠降低鼻或肺定植的肺炎球菌，并抵御不同種血清型肺炎球菌的感染，腹腔內接種DnaJ蛋白也能夠抵御不同種血清型肺炎球菌的感染，DnaJ是肺炎球菌具潛力的候選蛋白疫苗[14]。本試驗發現，布魯氏菌DnaJ蛋白可誘導較好的細胞和體液免疫，因此，該蛋白可作為候選的亞單位疫苗。

熱休克蛋白的誘導合成對于致病菌在宿主體內存活至關重要[15]。肺炎鏈球菌DnaJ蛋白具有良好的免疫原性，且與其感染致病力相關[16]。研究表明，DnaJ在遲緩愛德華氏菌的致病中發揮重要作用，且具有免疫保護作用，因此DnaJ可用于控制水產養殖中的遲緩愛德華氏菌感染[17]。布魯氏菌的應激反應蛋白毒力因子包括Hfq、DnaK、DnaJ、HtrA和Lon。研究表明，Hfq在布魯氏菌致病中可調控大量靶標基因的表達水平，影響布魯氏菌在宿主體內的慢性持續性感染[18-19]。然而，目前只初步證明Lon、htrA、DnaJ和DnaK影響布魯氏菌的毒力[20-23]，它們在布魯氏菌致病中的作用機制尚不清楚。本課題組前期已經獲得了可作為候選疫苗株的布魯氏菌Hfq和DnaK基因缺失株，因此后期也將進一步構建DnaJ基因缺失株，獲得DnaJ基因調控布魯氏菌的毒力機制。