重點區域規模化牧場牛奶源大腸桿菌耐藥性研究

劉欣彤 ， 陳孝杰 ， 王玉鳳 ， 鄧 翠 ， 于志亞 ， 張向陽 ， 張志博 ，劉義明 ， 徐 飛 ， 李 存 ， 李秀波

(1.天津農學院動物科學與動物醫學學院 ， 天津 西青 300384 ； 2. 中國農業科學院飼料研究所 ，國家飼料中藥物基準實驗室 ， 北京 海淀 100081 ； 3. 新鄉學院生命科學技術學院 ， 河南 新鄉 453000 ；4. 東北農業大學動物醫學院 ， 黑龍江 哈爾濱 150030)

奶牛乳房炎(Bovine mastitis)是由多種病原微生物侵入泌乳奶牛乳腺組織所引發的一種持續性炎癥反應，是泌乳奶牛最常見的疾病，也是造成奶牛畜牧養殖業和奶牛乳品生產業損失最嚴重的疾病[1]。該病流行于世界各地，發病率高且防治困難。引起奶牛乳房炎的微生物種類有很多，如細菌、真菌、病毒、支原體等，以細菌感染較常見，主要包含大腸埃希菌、葡萄球菌、鏈球菌和沙門菌等[2]。當奶牛患有乳房炎時，其產奶量及乳制品質量均會顯著降低，不僅影響奶牛的健康，還會降低養殖效益并增加奶牛治療成本，甚至會由于抗生素濫用催生多重耐藥超級細菌[3]。

大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)又稱大腸埃希菌，廣泛存在于環境中，雖然大部分大腸桿菌為動物腸道的正常寄生菌之一，但也有一小部分為重要的條件性致病菌，是奶牛乳房炎的細菌檢測中重要的環境病原菌[4-5]。20世紀中期，有學者認識到一些特殊血清型的大腸桿菌對嬰兒和幼畜(禽)有致病性，常引起嚴重腹瀉、腎炎、敗血癥等，導致畜禽生長發育緩慢，生產能力下降，甚至死亡，給畜牧養殖業帶來嚴重的經濟損失[6-7]。

本研究對全國重點區域規?；膛ｐB殖場健康奶樣和臨床乳房炎奶樣進行細菌學分離，并對牛奶源大腸桿菌分離株進行體外藥物敏感性試驗，以了解牛奶源大腸桿菌的分離率和藥物敏感性，提高藥物治療效率，避免同種藥物多次使用造成的耐藥性，為獸醫臨床合理有效地使用抗菌藥物提供臨床參考數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 標準菌株 大腸桿菌標準菌株ATCC25922，購自廣東省微生物所(廣東環凱微生物科技有限公司)。

1.1.2 主要試劑與培養基 乙二胺四乙酸(EDTA)、二甲基甲酰胺(DMF)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硼酸、冰醋酸、無水乙醇、丙三醇，均購自國藥集團化學試劑有限公司；氫氧化鈉，購自北京化工廠；Tris Base，購自北京索萊寶科技有限公司；腦心浸液肉湯(BHI broth)、MH肉湯(MH broth)、LB肉湯(LB broth)、伊紅美藍瓊脂培養基(EMB)、麥康凱瓊脂培養基(Macconkey agar)、水解酪蛋白瓊脂(MH agar)、LB瓊脂(Luria-Bertani agar)，均購自青島海博生物技術有限公司。

1.1.3 抗菌藥物 氨芐西林(Ampicillin，AMP)、頭孢他啶(Ceftazidime，CAZ)、頭孢曲松(Ceftriaxone，CRO)、頭孢噻肟(Cefotaxime，CTX)、頭孢西丁(Cefoxitin，FOX)、阿米卡星(Amikacin，AMK)、安普霉素(Apramycin，APR)、慶大霉素(Gentamycin，GEN)、新霉素(Neomycin，NEO)、鏈霉素(Streptomycin，STR)、多西環素(Doxycycline，DOX)、氯霉素(Chloramphenicol，CHL)、氟甲砜霉素(Florfenicol，FFC)、多黏菌素E(Colistin，CL)、亞胺培南(Imipenem，IMP)、美羅培南(Meropenem，MEM)、環丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)、恩諾沙星(Enrofloxacin，ENR)，均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.4 試驗儀器 超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司產品；TC-96/G/H(b)C型PCR儀，杭州博日科技有限公司產品；SQ810C型立式高壓滅菌鍋，廈門和譜儀器有限公司產品；DHP-9162型電熱恒溫培養箱，北京利康達圣科技有限公司產品；ZWYR-D2403型恒溫振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司產品；臺式高速離心機，德國Eppendorf公司產品；DK-8D三孔電熱恒溫水浴鍋，上海島韓實業有限公司產品；電子分析天平，北京賽多利斯科學儀器有限公司產品；電子天平YP202N，菁海儀器(上海)有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集 2017—2018年，從全國11個奶牛重點養殖區域的52個規?；翀龉膊杉Ｄ虡颖? 309份。依照GB 4789.1—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 總則》進行樣本采集。采集完成后，低溫條件下運送至實驗室。

1.2.2 菌株分離 將牛奶樣本接種于腦心浸液肉湯，37 ℃恒溫增菌，過夜培養16～24 h后用接種環挑取培養物劃線接種于伊紅美藍瓊脂平板，置于37 ℃恒溫培養箱過夜培養16～24 h，然后挑取伊紅美藍瓊脂上黑紫色、圓形、隆起、光滑且對光觀察具有金屬光澤的單個疑似大腸桿菌菌落，于伊紅美藍培養基上進行純化培養，將純化的大腸桿菌于LB瓊脂培養基上涂板增菌，保存于30%甘油肉湯中，-80 ℃備用。

1.2.3 藥敏試驗 嚴格按照美國臨床和實驗室標準協會(Clinicai and Laboratory Standards Institute，CLSI)推薦的細菌藥物敏感性試驗紙片法與稀釋法執行標準。采用瓊脂稀釋法對牛奶源大腸桿菌進行抗微生物的藥物敏感性試驗。

2 結果

2.1 菌株分離 從2 309份牛奶樣品中分離出687株大腸桿菌，總分離率為29.75%。分離純化菌株在伊紅美藍瓊脂培養基上的生長培養特性、菌體形態、菌落特征及革蘭染色和生化鑒定特性均符合大腸桿菌的特征；同時采用16S rRNA PCR進行分子生物學輔助鑒定。其中2017年從17個牧場的811份牛奶樣本中分離鑒定到252株大腸桿菌，分離率為31.07%；2018年從35個牧場的1 498份牛奶樣本中分離鑒定出435株大腸桿菌，分離率為29.04%。京津冀魯區域牛奶中大腸桿菌的分離率為18.60%～34.86%，其中北京地區分離率最高，其次是天津地區及河北地區，山東地區分離率最低；東北地區分離率相似(遼寧地區24.55%、吉林地區24.14%)；上海、貴陽等其他地區分離率差異較大，貴陽地區最高(52.99%)，上海地區最低(9.29%)。2017—2018年全國重點區域規?；翀雠Ｄ淘创竽c桿菌分離率見圖1。

圖1 2017—2018年重點區域規?；翀雠Ｄ淘创竽c桿菌分離率Fig.1 Prevalence of E.coli in milk samples collected during 2017—20181：北京; 2：天津; 3：河北; 4：山東; 5：遼寧; 6：吉林; 7：上海; 8：貴陽; 9：成都; 10：寧夏; 11：石河子1：Beijing; 2：Tianjin; 3：Hebei; 4：Shandong; 5：Liaoning; 6：Jilin; 7：Shanghai; 8：Guiyang; 9：Chengdu; 10：Ningxia； 11：Shihezi

2.2 藥敏試驗

2.2.1 牛奶源大腸桿菌對18種抗菌藥物的耐藥結果 對分離純化獲得的大腸桿菌菌株進行臨床抗菌藥物敏感性試驗，結果顯示，2017年分離到的252株大腸桿菌，對氨芐西林及多西環素的耐藥率高，分別為40.98%和36.63%，其次是頭孢曲松(31.28%)、鏈霉素(29.23%)、頭孢噻肟(22.50%)、氟甲砜霉素(22.42%)和氯霉素(19.26%)，對人醫臨床非常重要的2類藥物多黏菌素和美羅培南未發現耐藥或耐藥率極低，分別為0.47%和0；2018年分離到的435株大腸桿菌，對氨芐西林及鏈霉素的耐藥率高，分別為25.74%和19.59%，其次是頭孢曲松(18.00%)、頭孢噻肟(17.08%)和多西環素(14.35%)，而亞胺培南和美羅培南未發現耐藥；其中18種抗菌藥物的耐藥率均未超過50.00%。牛奶源大腸桿菌菌株對18種抗菌藥物的藥物敏感性試驗結果見表1。

表1 679株牛奶源大腸桿菌對18種抗菌藥物的敏感性試驗Table 1 Antimicrobial susceptibility of 679 E. coli isolates to 18 antibiotics (%)

2.2.2 2017—2018年重點區域牛奶源大腸桿菌對18種抗菌藥物的耐藥結果 對分離純化獲得的大腸桿菌菌株進行臨床抗菌藥物敏感性試驗，結果顯示，在樣品采集的11個奶牛重點養殖區域中，上海、貴陽、寧夏3個地區奶牛源大腸桿菌耐藥性最嚴重，上海地區牧場大腸桿菌對氨芐西林耐藥率達88.89%，其次是貴陽58.82%；京津冀區域中以β-內酰胺類藥物(氨芐西林49.08%，頭孢曲松32.07%，頭孢噻肟27.73%)、鏈霉素(22.84%)、多西環素(23.47%)和氯霉素類(7.33%)耐藥為主，在這3個區域中天津地區大腸桿菌耐藥最嚴重(氨芐西林耐藥達80.65%)，其次是河北地區奶牛牧場，北京牧場最輕，河北地區阿米卡星耐藥率5.71%；遼寧和吉林地區牛奶源大腸桿菌耐藥譜相似，耐藥率最高的5類藥物均為氨芐西林(30.82%)、頭孢曲松(25.40%)、頭孢噻肟(23.54%)、鏈霉素(20.14%)和多西環素(16.41%)；山東地區牛奶源大腸桿菌對臨床18種抗菌藥物耐藥率較低，耐藥率最高為環丙沙星，僅20.00%，其次是氨芐西林(17.50%)和恩諾沙星(15.00%)；成都區域對牛奶源大腸桿菌耐藥率最高的幾類藥物分別是鏈霉素(26.92%)、氨芐西林(19.23%)和慶大霉素(17.31%)，其中頭孢西丁耐藥程度在11個區域中最高，達到13.46%，高于上海地區的11.11%和貴陽地區的10.00%；新疆石河子地區在11個地區奶牛牧場中，耐藥率最低，介于0～14.29%，鏈霉素耐藥率最高(14.29%)，遠低于上海(44.44%)、寧夏(37.50%)、吉林(29.17%)和天津地區(29.03%)的耐藥率。

碳青霉烯類(亞胺培南、美羅培南)和多黏菌素類藥物在11個地區牛奶源大腸桿菌中均未檢測到耐藥性[北京地區的多黏菌素(0.76%)除外]；氨基糖苷類藥物的阿米卡星和安普霉素除個別牧場外(河北地區阿米卡星5.71%、寧夏地區安普霉素6.25%)，均處于極低耐藥水平，極低于同類藥物的慶大霉素、新霉素和鏈霉素的耐藥率。重點區域規?；翀龃竽c桿菌分離株對18種抗菌藥物的藥物敏感性試驗結果見表2和圖2。

圖2 2017—2018年重點區域規?；翀?79株牛奶源大腸桿菌對18種抗菌藥物的敏感性試驗Fig.2 Antimicrobial susceptibility of 679 E. coli isolates to 18 antibiotics during 2017—2018AMP：氨芐西林; CAZ：頭孢他啶; CRO：頭孢曲松; CTX：頭孢噻肟; FOX：頭孢西丁; AMK：阿米卡星; APR：安普霉素; GEN：慶大霉素; NEO：新霉素; STR：鏈霉素; DOX：多西環素; CHL：氯霉素; FFC：氟甲砜霉素; CL：多黏菌素E; IMP：亞胺培南; MEM：美羅培南; CIP：環丙沙星; ENR：恩諾沙星AMP：Ampicillin; CAZ：Ceftazidime; CRO：Ceftriaxone; CTX：Cefotaxime; FOX：Cefoxitin; AMK：Amikacin; APR：Apramycin; GEN：Gentamycin; NEO：Neomycin; STR：Streptomycin; DOX：Doxycycline; CHL：Chloramphenicol; FFC：Florfenicol; CL：Colistin; IMP：Imipenem; MEM：Meropenem; CIP：Ciprofloxacin; ENR：Enrofloxacin

表2 2017—2018年重點區域規模化牧場679株牛奶源大腸桿菌對18種抗菌藥物的敏感性試驗Table 2 Antimicrobial susceptibility of 679 E. coli isolates to 18 antibiotics during 2017—2018 (%)

3 討論

隨著奶牛乳房炎致病菌的耐藥性逐漸加重，臨床上使用抗菌藥物的防治效果也越來越差，且同一種屬的不同菌株對不同的抗菌藥物的敏感性也存在極大的差異[8]。牛奶中抗菌藥物的殘留不僅會導致乳制品質量下降，還會危及人類健康[9]。所以，正確的抗菌藥物敏感性試驗結果，對該地區養殖戶以及臨床獸醫合理用藥具有重要的參考價值，并可降低對人類健康的危害[10]。因此，本研究對牛奶源大腸桿菌進行了分離鑒定和藥敏試驗。

本研究從牛奶樣品中共分離出687株菌株，通過形態學觀察、革蘭染色、生化特性分析及分子生物學方法對其進行綜合鑒定，均為大腸桿菌。分離鑒定結果顯示，貴陽地區的分離率最高，為52.99%，說明該地區大腸桿菌引起的奶牛乳房炎最為嚴重。京津冀魯區域中，北京地區的分離率最高，可能與經濟交通發達有關。東北區域的分離率相似，可能與氣候和地理環境相似有關。上海地區的分離率最低，為9.29%，說明該地區大腸桿菌引起的奶牛乳房炎的防治效果較好，其奶牛場環境衛生與奶牛飼養管理方面俱佳，有效防控了奶牛乳房炎的發生和流行。石河子地區屬于典型的溫帶大陸性氣候，溫差較大，日照時間充足，這為大腸桿菌傳播提供了有利的條件，因此本研究中該地區大腸桿菌的分離率高居第2位，為37.57%。成都地處四川盆地，屬于亞熱帶季風性濕潤氣候、氣候溫和、雨量豐沛，有利于大腸桿菌的生長繁殖，因此本研究中該地區大腸桿菌的分離率也高達35.37%。

本研究對687株大腸桿菌進行18種抗菌藥物的敏感性試驗分析，結果表明大腸桿菌對臨床上使用的抗菌藥物均產生了不同程度的耐藥，尤其對氨芐西林、鏈霉素及多西環素的耐受性最高，其可能是由于該奶牛場長期使用上述常規抗生素或此菌株由牛場外傳入引起奶牛發病，在傳入之前已經對上述常規抗生素產生耐藥性。而對多黏菌素、亞胺培南和美羅培南的耐受性極低甚至無耐受性，該試驗結果基本能反映目前全國重點區域對部分抗菌藥的耐藥性情況。因此，在治療因感染大腸桿菌而致的奶牛乳房炎時，應選用經藥敏試驗確證為高效的2～3種敏感藥物，按療程和足夠的劑量交替治療，減少抗生素殘留和耐藥性的危害，降低奶牛乳房炎的治療成本[11]。

徐繼英等[12](2012年)的研究結果中，國內7個省、市、自治區部分地區乳樣中大腸桿菌的分離率低于本試驗，且對阿米卡星、慶大霉素和氯霉素的耐藥性高于本試驗；張連梅等[13](2013年)報道的寧夏地區奶樣中大腸桿菌的分離率低于本試驗寧夏地區的分離率；余婷等[14](2013年)對寧夏地區奶牛場分離出大腸桿菌的耐藥性進行分析，結果顯示對氨芐西林、頭孢噻肟、鏈霉素、慶大霉素、多西環素和多黏菌素的耐藥性高于本試驗，而對恩諾沙星和環丙沙星的耐藥率低于與本試驗；孫芳芳等[15](2014年)報道的沈陽地區奶牛場奶樣大腸桿菌的分離率與本試驗遼寧地區大致相同，其中氨芐西林與鏈霉素的耐藥率與本試驗遼寧地區基本相同，而慶大霉素與環丙沙星的耐藥率與本試驗遼寧地區有一定差異；賈林軍等[16](2014年)對新疆地區的奶樣進行了分離鑒定，大腸桿菌的分離率為9.5%，低于本試驗新疆地區，其中對氨芐西林、慶大霉素和鏈霉素耐藥率高于本試驗新疆地區；劉春杰等[17](2014年)研究結果顯示，吉林奶牛場的乳樣分離率為24%，與本試驗吉林地區基本相同，且對環丙沙星的低耐藥率與本試驗吉林地區基本相同，而對氨芐西林和慶大霉素的耐藥率與本試驗吉林地區有一定差異；楊淑華等[18](2015年)報道的遼寧地區奶牛場采集的乳樣中大腸桿菌的分離率為20.26%，與本試驗遼寧地區基本相同；薛梅等[19](2015年)對山東省奶牛場采集的奶樣進行分離鑒定，大腸桿菌的分離率為16.32%，與本試驗山東地區基本相同，且對頭孢噻肟的低耐藥率與本試驗山東地區基本相同，而對鏈霉素、阿米卡星和恩諾沙星的耐藥率高于本試驗山東地區；許丹丹等[20](2015年)從新疆石河子地區奶牛場采集的313份奶樣中分離出16株大腸桿菌，分離率為5.11%，低于本試驗新疆地區，且對慶大霉素、氨芐西林、鏈霉素的耐藥率高于本試驗新疆地區；姚偉等[21]等(2016年)報道的遼寧地區某大型奶牛場采集的奶樣中大腸桿菌分離率為76%(57/75)，遠高于本試驗遼寧地區，且對慶大霉素的低耐藥率與本試驗遼寧地區相同，而對氨芐西林、多西環素、環丙沙星、恩諾沙星的耐藥率高于本試驗遼寧地區；楊彩霞等[22](2016年)的研究結果表明，遼寧地區16家規?；膛霾杉虡又写竽c桿菌的分離率為55.63%，高于本試驗遼寧地區，且對氨芐西林、鏈霉素、氯霉素和多西環素的耐藥率與本試驗遼寧地區基本一致，而對多黏菌素的高耐藥率與本試驗遼寧地區相反；高曉偉等[23](2016年)從吉林長春地區采集的231份奶樣中分離出54株大腸桿菌，分離率為23.37%，與本試驗吉林地區基本相同，且對鏈霉素、環丙沙星的耐藥率與本試驗吉林地區基本相同，而對多西環素、慶大霉素的耐藥性與本試驗吉林地區有一定差異；張倩等[11](2016年)報道的新疆石河子地區規?；龅?5份奶樣中分離出大腸桿菌27株，占31.76%，與本試驗新疆地區基本相同，且對阿米卡星、恩諾沙星、氟甲砜霉素的耐藥率與本試驗石河子地區基本相同，而對氨芐西林、多黏菌素的耐藥率高于本試驗石河子地區；王雪梅等[24](2017年)對四川成都地區采集的奶樣進行分離鑒定，大腸桿菌分離率為14.16%，低于本試驗成都地區，且對鏈霉素的耐藥率低于與本試驗成都地區，而對頭孢噻肟和慶大霉素的耐藥率遠遠高于本試驗四川地區；李寧等[25](2018年)的研究結果顯示，遼寧地區采集的89份奶樣中分離出25株大腸桿菌，分離率28.09%，與本試驗遼寧地區基本相同，且對頭孢噻肟的耐藥性與本試驗遼寧地區基本相同，而對頭孢西丁、阿米卡星、慶大霉素、亞胺培南及環丙沙星的耐藥率均高于與本試驗遼寧地區。

由此可見，不同地區大腸桿菌的分離率存在不同程度的差異，這不僅與奶牛場環境衛生、奶牛飼養管理和用藥習慣等有關系，還與氣候和地理環境等有直接關系。因此，應加強奶牛的飼養管理，改善牛舍及周圍環境衛生，保持牛舍通風干燥且定期清洗牛舍和對牛舍進行滅菌消毒。此外，要定期對奶牛進行檢查，對久治不愈的臨床型乳房炎患牛應淘汰。同時應規范擠奶程序，做好擠奶用具的消毒工作，防止擠奶過程中的微生物感染。