食品中玉米赤霉烯酮檢測結(jié)果測量不確定度的評定

徐宏巖

（阜陽市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，安徽阜陽 236000）

玉米赤霉烯酮是玉米赤霉病的代謝產(chǎn)物，又稱為F-2霉素，廣泛存在于小麥、玉米等谷類作物中，是主要由禾谷鐮刀菌產(chǎn)生的一種次級代謝產(chǎn)物，對人體和動物健康非常不利。玉米赤霉烯酮具有雌激素的作用，對雌性動物的生殖系統(tǒng)破壞性大，可引起動物出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎等現(xiàn)象。同時，其具有潛在致癌性，可導(dǎo)致免疫系統(tǒng)及肝腎損傷[1]。

玉米赤霉烯酮分子式為C18H22O5，是一種酚的二羥基苯酸的內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，不溶于水、四氧化碳和二硫化碳，但能溶于醇類、乙酸乙酯、乙醚和堿性水溶液，微溶于石油醚。目前，對玉米赤霉烯酮的檢測方法有生物傳感器法、酶聯(lián)免疫法、氣相色譜法和高效液相色譜等[2]。本文按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中玉米赤霉烯酮的測定》（GB 5009.209—2016）中的液相色譜法測定小麥粉中的玉米赤霉烯酮含量，并建立數(shù)學(xué)模型，對各不確定度分量進(jìn)行評定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

實驗用小麥粉樣品為中國檢驗檢疫科學(xué)研究院測試評價中心提供的能力驗證樣品；標(biāo)準(zhǔn)品玉米赤霉烯酮（純度≥98.0%，加拿大TRC公司）；甲醇；乙腈；氯化鈉；氯化鉀；磷酸氫二鈉；磷酸二氫鉀；葉溫-20；鹽酸；玻璃纖維濾紙（直徑11 cm，孔徑1.5 μm，無熒光特性）。

1.1.2 儀器與設(shè)備

1260高效液相色譜儀（配有熒光檢測器，美國安捷倫公司）；ST 8R高速粉碎機（轉(zhuǎn)速≥12 000 r/min）；均質(zhì)器（轉(zhuǎn)速≥12 000 r/min）；高速勻質(zhì)器（轉(zhuǎn)速18 000 r/min～22 000 r/min，德國IKA公司）；氮吹儀（美國ThermosFisher公司）；空氣壓力泵；玻璃注射器（10 mL）；天平（感量0.000 1 g和0.01 g，瑞士METTLER TOLEDO公司）；玉米赤霉烯酮免疫親和柱（柱規(guī)格1 mL或3 mL，柱容量≥1 500 ng，或等效柱）。

1.1.3 試劑配制

①提取液配制。乙腈-水（9+1，V/V）。②PBS清洗緩沖液配制。稱取8.0 g氯化鈉、1.2 g磷酸氫二鈉、0.2 g磷酸二氫鈉和0.2 g氯化鉀，加入990 mL水將試劑溶解，用鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，加水定容至1 L。③PBS/吐溫-20緩沖液配制。稱取8.0 g氯化鈉、1.2 g磷酸氫二鈉、0.2 g磷酸二氫鈉和0.2 g氯化鉀，加入900 mL水將試劑溶解，用鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，加入1 mL吐溫-20，加水定容至1 L[3]。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

①標(biāo)準(zhǔn)儲備液。稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品放入乙腈中溶解，標(biāo)準(zhǔn)品需精確到0.000 1 g，按照100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)配制標(biāo)準(zhǔn)儲備液，避光保存，溫度在-18 ℃以下。②系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。吸取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用流動相稀釋，配制成10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL和500 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，避光保存，溫度為4 ℃。③樣本加標(biāo)。稱取小麥粉樣品40 g，加入100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.10 mL，混合均勻。

1.2.2 測定方法

試樣用乙腈溶液提取，經(jīng)免疫親和柱凈化后，使用高效液相色譜熒光檢測器測定。小麥粉中玉米赤霉烯酮含量測定步驟如圖1。

圖1 小麥粉中玉米赤霉烯酮測定步驟

1.2.3 色譜條件

色 譜 柱：Agilent XDB C18，10 cm×0.3 cm，1.8 μm；流動相：乙腈-水-甲醇（46∶46∶8，V/V）；流速：0.6 mL/min；檢測波長：激發(fā)波長274 nm，發(fā)射波長440 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：35 ℃。

1.2.4 數(shù)學(xué)模型

玉米赤霉烯酮的含量按公式（1）計算：

式中：X為試樣中玉米赤霉烯酮的含量，μg/kg；c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得進(jìn)樣液中玉米赤霉烯酮的濃度，ng/mL；V為試樣的定容體積，mL；V1為移入免疫親和柱的濾液體積，mL；m為樣品的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液測定結(jié)果

配制玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)濃度為10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL和500 ng/mL，進(jìn)行分析測試，結(jié)果見表1。根據(jù)表1作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，線性方程為y=6.515×10-4x-7.983，相關(guān)系數(shù)r=0.998 1。將加標(biāo)后的小麥粉樣品在相同實驗條件下測量6次，測定結(jié)果見表2。

表1 標(biāo)準(zhǔn)溶液系列測定結(jié)果

表2 樣品重復(fù)性測定結(jié)果

2.2 不確定性來源分析

玉米赤霉烯酮含量的測定過程包括制備標(biāo)準(zhǔn)液、制備樣品和儀器測定。測量不確定度可能來源于玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液校正；玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品純度及樣品稱量；樣品稱量和配制測量液定容；實驗重復(fù)性測量等[4]。不確定度來源見圖2。

圖2 小麥粉中玉米赤霉烯酮不確定度來源

2.3 擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線求值引入的不確定度

繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度X，縱坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品峰面積Y。殘余標(biāo)準(zhǔn)差S和自變量偏差平方和Sxx，計算公式如下：

測量樣品溶液6次，由擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線求值引入的不確定度計算公式如下：

P=6，根據(jù)表1、表2數(shù)據(jù)，計算得到擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線求值的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(R)=0.35%。

（1）標(biāo)準(zhǔn)品純度及稱量引入的不確定度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書，玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)樣品的純度為100.0 μg/mL，純度偏差為 ±1.2 μg/mL，按照正態(tài)分布估算，取包含因子為2，則標(biāo)準(zhǔn)樣品純度的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(n)=1.2%。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為液體，無需電子天平稱量，標(biāo)準(zhǔn)品稱量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(m1)=0。

（2）使用移液槍定容引入的不確定度。根據(jù)檢定規(guī)程，標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中使用移液槍移取

2.4 標(biāo)準(zhǔn)液濃度引入的測量不確定度

液體，取矩形分布。配制過程中使用10 mL移液槍1次和1 mL移液槍7次，移液槍引入的不確定度分量見表3，移液槍引入的相對不確定度為urel(V1)=1.54%。

表3 移液槍引入的不確定度分量

2.5 樣品配制測量引入的測量不確定度

（1）樣品稱量引入的不確定度。電子天平按照附機參數(shù)和檢定說明確定線性和重復(fù)性分別為±1 mg，假設(shè)其服從矩形分布[5]。稱量樣品約為40 g，實際測量時，使用電子天平進(jìn)行去皮前后2次測量，測量結(jié)果強相關(guān)，樣品稱量帶來的標(biāo)準(zhǔn)不確定度其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(m2)=0.004%。

（2）樣品移取與體積定容引入的不確定度。本次實驗使用了2次10 mL移液槍，移液槍引入的相對不確定度為urel(V)=0.08%。實驗室溫度變化范圍為±5 ℃，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，屬于B類不確定度，假設(shè)為矩形分布，實驗室溫度引入的不確定度為u(t)=0.061%。因此，樣品體積引入的相對不確定度

2.6 實驗重復(fù)性測量引入的不確定度

實驗重復(fù)性測量引入的不確定度采用A類評定。根據(jù)表2數(shù)據(jù)，格拉布斯檢驗0.95置信水平下無粗大異常值。根據(jù)貝賽爾公式，計算出6次測量的標(biāo)準(zhǔn)差的相對值為。實測時以雙實驗平均值表示測量結(jié)果，測量結(jié)果的A類相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.7 相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對擴(kuò)展不確定度

將不確定度的A類評定結(jié)果和各分量評估結(jié)果合成，得出相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

以任意2次測量結(jié)果平均值為檢測結(jié)果（如第1次測量和第5次測量），玉米赤霉烯酮=19.66 μg/kg，取包含因子k=2，則玉米赤霉烯酮殘留含量的測量結(jié)果及其相對擴(kuò)展不確定度可表征為=19.66 μg/kg，Urel=12.1%。

3 結(jié)論

通過對小麥粉中玉米赤霉烯酮不確定度進(jìn)行評定分析，發(fā)現(xiàn)實驗重復(fù)性測量引入的不確定度最大，其次為標(biāo)準(zhǔn)品純度及標(biāo)準(zhǔn)品稱量引入的不確定度；樣品稱樣和樣品體積定容中10 mL移液槍引入的不確定度較小，在實際計算中可忽略不計。因此，進(jìn)行實驗時應(yīng)注意重復(fù)性測量及標(biāo)準(zhǔn)品的選擇，設(shè)置合理的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍。實驗人員應(yīng)規(guī)范操作，在復(fù)雜的樣品處理過程中盡量降低不確定度，提高檢測精度和質(zhì)量。