黃鱔轉鐵蛋白基因的克隆及其N-lobe 的重組表達

鄭淑婷，臧彧偉，楊龍，李偉

（長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025）

轉鐵蛋白（Transferrin，Tf）是一種鐵離子結合蛋白，典型的Tf 為70～80 kD 的β-球蛋白，包括位于分子N 端和C 端2 個氨基酸序列相似的結構域，每個結構域都能結合一個鐵離子[1,2]。Tf 最初在人、魚類、兩棲類和爬行類血清中被發現[3,4]，是運輸和代謝鐵離子的重要因子，具有調節細胞增殖和免疫系統的作用，參與抗菌殺菌和細胞保護過程[5,6]。Tf的抗菌殺菌機理可能與Tf 的螯合鐵特性、遺傳多態性和糖基（碳水化合物）三個方面有關[2,7]。20 世紀80年代至今，人們已完成虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）等多種魚類Tf基因的克隆，證實了魚類Tf 氨基酸序列的保守性以及運輸鐵離子功能的穩定性[8,9]。

假單胞桿菌（Pseudomonas spp.）是遺傳多樣性豐富的革蘭氏陰性桿菌[10]。本研究中所用假單胞桿菌為本實驗室從馴養的黃鱔（Monopterus albus）腸道分離出的一種非致病微生物。臧彧偉等[11]克隆了黃鱔腸道假單胞桿菌Bfr 基因，并實現了融合表達，發現添加外源Bfr 蛋白促進了假單胞桿菌的營養生長。魚類Tf 對嗜水氣單胞菌等病原菌的生長有抑制作用[12]，但尚無魚類Tf 對假單胞桿菌等非致病菌生長影響的相關報道。

黃鱔是一種常見的淡水養殖魚類，廣泛分布于中國、印度等東南亞國家的溪流、池塘和稻田中，具有豐富的營養和藥用價值[13]。沈志民等[14]分離純化了黃鱔血清Tf，分析了其氨基酸組成；王博文等[15]分離純化了黃鱔血清Tf，得到了黃鱔血清Tf 蛋白，表征分析了其表面形態與二級結構；雷華明等[16]克隆了黃鱔Tf 的C 端基因序列，進行重組表達并制備了其多克隆抗體。但對黃鱔血清轉鐵蛋白Tf 基因全長及其抑菌能力的研究尚無相關報道。

本研究采用RACE-PCR 技術克隆了黃鱔血清Tf 全長cDNA 序列，并進行了生物信息學分析，構建了該基因N-lobe 的原核表達載體，實現了重組蛋白的誘導表達和分離純化，探究了黃鱔Tf 蛋白對腸道假單胞桿菌生長的影響，為深入了解黃鱔血清Tf的功能積累基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒與菌株

原核表達載體pET28a（Novagen 公司）；大腸桿菌感受態DH5α、BL21（DE3）、pEASY-T1 克隆載體等（北京全式金）；黃鱔腸道假單胞桿菌菌株由長江大學生物醫藥研究所鑒定并保存。

1.1.2 主要試劑

小鼠抗6His-tag 單克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗鼠IgG（Proteintech 公司）；硝酸纖維素膜、DAB 顯色試劑盒（武漢谷歌生物）；蛋白質分子量標準、質粒DNA 提取試劑盒、瓊脂糖膠回收試劑盒、DNA 聚合酶（北京全式金）；Ni-NTA His·Bind Resin 親和柱（上海七海生物）；其他試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 黃鱔Tf 基因的克隆及序列分析

根據GenBank 數據庫人類（Homo sapiens，AAH59367.1）、小鼠（Mus musculus，NP_ 598738.1）和牙鲆（Paralichthys olivaceus，AAF33234.1）等不同物種的Tf 基因序列設計一對基因簡并性引物De-Tf-F 和De-Tf-R（表1），以黃鱔肝臟cDNA 為模板，進行PCR 擴增，PCR 產物經凝膠回收試劑盒純化后克隆至pEASY-T1 載體，選取陽性菌落進行測序驗證。將測序結果于NCBI 中比對，獲得Tf 保守區序列，再以該段序列作為模板設計特異性外側引物和內側引物Tf-GSP5 和Tf-GSP3（表1），進行5’-RACE 和3’-RACE 片段擴增。根據制造商的說明，使用試劑盒進行RACE-PCR 擴增。PCR 產物經凝膠回收試劑盒純化后，與pEASY-T1 載體連接，轉化至DH5α 感受態細胞中，挑取至少3 個陽性克隆進行序列測定驗證。將所得cDNA 片段與5’和3’所得cDNA 末端拼接后即得到黃鱔Tf 基因全長cDNA 序列。設計引物Orf-F 與Orf-R（表1）擴增黃鱔Tf 開放閱讀框并測定序列。利用NCBI 數據庫對測序所得序列進行氨基酸同源性比對，并采用MEGA4.0 軟件繪制系統進化樹。

表1 本研究中所用到的引物Tab.1 Primers used in this study

1.2.2 原核表達載體的構建

根據拼接后得到的黃鱔Tf 基因全長cDNA 序列，設計基因特異性引物Rc-tf-F 和Rc-tf-R，以黃鱔肝臟cDNA 為模板擴增黃鱔Tf 基因N 端序列。上下游引物分別添加EcoRⅠ與NotⅠ限制性酶切位點，對擴增產物與pET28a 載體進行EcoRⅠ+NotⅠ雙酶切，回收的載體與基因按一定比例進行連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5α 感受態細胞，對重組質粒進行測序驗證，測序正確的重組質粒命名為pET28a/Tf-N。

1.2.3 重組蛋白的誘導表達及純化

將測序正確的pET28a/Tf-N 重組質粒轉化大腸桿菌BL21 感受態細胞，涂布于LB 平板（含50 μg/mL Kana）上，37℃過夜培養。挑取單克隆接種于LB 培養基（含50 μg/mL Kana）中，37℃、220 r/min 振蕩培養至菌液OD600約為0.6 時，加入終濃度為0.1 mmol/L 的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），繼續37℃、220 r/min 誘導培養4 h。SDS-PAGE 凝膠電泳檢測Tf-N 蛋白的表達結果。取200 μL 檢測表達的原菌液，加入200 mL LB 培養基中（含50 μg/mL Kana）中，擴大培養至菌液OD600約為0.6 時，加入終濃度為0.1 mmol/L 的IPTG 誘導培養4 h。誘導培養后的菌液4℃、10 000 r/min 離心10 min 收集菌體，加入5 mL PBS 緩沖液（50 mmol/L，pH8.3）重懸菌體。菌體重懸液置于冰上超聲波破碎15 min，破碎過程中每破碎5 s，間隔5 s。菌液4℃、10 000 r/min離心10 min，棄上清。沉淀中加入5 mL PBS 緩沖液（50 mmol/L，pH8.3，含6 mol/L 鹽酸胍）重懸，置于4℃靜置1 h 以上，4℃、10 000 r/min 離心10 min，收集上清。上清用0.45 μm 濾膜過濾后加入Ni-NTA His·Bind Resin 親和柱結合1 h 以上后，使上清自由流下，加入5 mL PBS 緩沖液（50 mmol/L，pH8.3，含6 mol/L 鹽酸胍，100 mmol/L 咪唑）洗脫蛋白。利用SDS-PAGE 凝膠電泳檢測Tf-N 蛋白的純化結果。

1.2.4 重組蛋白的Western blot 檢測

將經IPTG 誘導的含pET28a/Tf-N 重組菌的菌液與純化所得的Tf-N 蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉移到硝酸纖維素膜上，置于TBST緩沖液（含5%脫脂牛奶）中4℃封閉過夜，取出后用TBST 緩沖液洗膜3 次，每次10 min。隨即加入小鼠抗His-tag 單克隆抗體（1∶5 000），37℃孵育2 h，用TBST 洗膜3 次，每次10 min。最后，加入HRP 標記的山羊抗小鼠二抗（1∶10 000）于37℃孵育2 h，TBST 洗滌后用DAB 顯色劑顯色。以經IPTG 誘導后的含pET28a 空質粒菌株的菌液為陰性對照，以未經IPTG 誘導后的含pET28a/Tf-N 重組菌的菌液為陽性對照。

1.2.5 重組蛋白抑菌活性的檢測

挑取假單胞桿菌單克隆于3 mL LB 液體培養基中，30℃、220 r/min 振蕩培養6～8 h，使菌液OD600約為0.6。用ddH2O 將活化好的假單胞桿菌稀釋至105～106cell/mL 后，取100 μL 稀釋的菌液涂布于LB固體培養基上，菌液稍干后放置牛津杯。用含3 mmol/L EDTA 的PBS 緩沖液（50 mmol/L，pH8.3）與不含EDTA 的PBS 緩沖液（50 mmol/L，pH8.3）分別將Tf-N 蛋白稀釋至180 μg/L、90 μg/L 和45 μg/L，各取稀釋的蛋白200 μL 加入固體培養基上的牛津杯中，隨后置于37℃培養過夜，觀察、測量抑菌圈直徑。用不含EDTA 的PBS 緩沖液（50 mmol/L，pH8.3）將加熱滅活的Tf-N 蛋白稀釋至180 μg/L、90 μg/L和45 μg/L，取200 μL 加入牛津杯中作為對照，實驗重復三次。

1.2.6 重組蛋白對假單胞桿菌鐵獲取作用的影響

挑取假單胞桿菌單克隆于10 mL 液體LB 培養基中，于30℃、220 μg/L 條件下振蕩培養6～8 h，至菌液OD600約為0.6。實驗分五組進行，每組取30 μL上述假單胞桿菌菌液加入30 mL LB 液體培養基中，第一組不添加FeCl3與蛋白作為陰性對照；第二組只添加960 μL FeCl3（1 mmol/L）不添加蛋白作為陽性對照；第三組中加入960 μL FeCl3（1 mmol/L）與100 μL Bfr 蛋白（100 μg/mL）；第四組中加入960 μL FeCl3（1 mmol/L）與100 μL Tf-N 蛋白（100 μg/mL）；第五組中加入960 μL FeCl3（1 mmol/L）、100 μL Bfr蛋白（100 μg/mL）與100 μL Tf-N 蛋白（100 μg/mL）。每組菌液補充ddH2O 至35 mL 后，置于30℃、220 μg/L 的條件下振蕩培養12 h，從培養3 h 起每隔1 h 取3 mL 菌液保存，每個時點的菌液取三次。用紫外分光光度計測量各時點菌液在600 nm 處的吸光值，以測量的吸光值表征菌液的生物量，實驗重復三次。

2 結果與分析

2.1 黃鱔Tf 基因序列

Tf cDNA（GenBank ID：AHA05992.1）全長2 426 bp，5'UTR 與3'UTR 分別為33 bp 與329 bp，含有2 064 bp 的開放閱讀框，編碼687 個氨基酸的多肽鏈，包含一個15 bp 的poly（A）尾（圖1）。

圖1 黃鱔Tf 基因的核苷酸序列及推斷的氨基酸序列Fig.1 The nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of swamp eel Tf gene

2.2 Tf 的同源性與系統進化樹分析

利用MEGA6.0 和DNAMAN 軟件，將黃鱔和其他23 個物種的Tf 氨基酸序列進行比對分析（圖2）。系統進化樹分析表明，黃鱔Tf 與其他魚類Tf 聚為一個分支，其中黃鱔與墨西哥脂鯉（Astyanax mexicanus）、青鳉（Oryzias latipes）、真鯛（Pagrosomus major）、大黃魚（Larimichthys crocea）等輻鰭亞綱物種進化地位較為接近，與兩棲動物、哺乳動物、鳥類和昆蟲明顯親緣關系較遠。

2.3 原核表達載體的構建、表達純化及鑒定

使用基因特異性引物對Rc-tf-F/R 從黃鱔肝臟cDNA 中擴增獲得片段，雙酶切后與用同樣限制性內切酶雙酶切的pET28a 連接，經測序驗證的重組質粒轉化BL21 感受態細菌，挑取陽性菌株用IPTG進行誘導重組蛋白的表達。SDS-PAGE 電泳結果顯示，相對于轉空白質粒的菌株與誘導前，誘導后產生了一條分子量約為33 kD 的條帶。通過Ni-NTA His Bind Resin 純化柱結合帶有His 標簽的蛋白，用100 mmol/L 咪唑洗脫Tf-N 蛋白，SDS-PAGE 電泳檢測顯示純化后基本無雜蛋白（圖3-A）。將SDS-PAGE 凝膠中蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，分別用小鼠抗6His-tag 單克隆抗體為一抗和HRP 標記的山羊抗小鼠二抗進行Western blot 免疫印跡顯示，帶有His 標簽的融合蛋白被特異性識別，顯示了一條33 kD 的條帶，而對照組未產生反應（圖3-B），說明已成功實現了重組蛋白Tf-N 的表達及純化。

圖3 重組蛋白Tf-N 的SDS-PAGE 檢測（A）與Western blot 分析（B）Fig.3 SDS-PAGE（A）and Western blot（B）analysis of total protein Tf-N

2.4 Tf-N 蛋白對假單胞桿菌的抑制作用

在涂布假單胞桿菌的LB 固體培養基中加入Tf-N 蛋白，通過觀察測量抑菌圈的大小判斷Tf-N蛋白對假單胞桿菌的抑制作用。結果顯示：與對照組相比，在涂布假單胞桿菌的平板上加入活性Tf-N蛋白會產生抑菌圈，且隨著Tf-N 蛋白濃度的增加，抑菌圈大小增加（圖4-A）。當加入的Tf-N 蛋白由含3 mmol/L EDTA 的PBS 緩沖溶液稀釋時，抑菌圈擴增程度高于加入相同濃度由不含EDTA 的PBS緩沖溶液稀釋的Tf-N 蛋白（圖4-B）。結果表明，Tf-N 蛋白可以抑制假單胞桿菌的生長，蛋白濃度越高抑制作用越顯著，同時EDTA 緩沖液對假單胞桿菌的生長也有抑制作用。

圖4 黃鱔重組蛋白Tf-N 抑菌活性檢測Fig.4 The antimicrobial activities of recombinant Tf-N on Pseudomonas spp.

2.5 Tf-N 蛋白對假單胞桿菌生長的影響

在假單胞桿菌菌液中外源添加Fe3+、Tf-N 蛋白與Bfr 蛋白，通過吸光值表征法測定假單胞桿菌培養不同時間的生物量，從而判斷Tf-N 蛋白對假單胞桿菌生長的影響。結果顯示：外源添加Fe3+的情況下，在假單胞桿菌菌液中單獨加入100 μL Bfr 蛋白（100 μg/mL）會促進假單胞桿菌的生長；而單獨加入100 μL Tf-N 蛋白（100 μg/mL）后，卻一定程度上抑制了假單胞桿菌的生長。將Bfr 蛋白（100 μg/mL）與Tf-N 蛋白（100 μg/mL）同時添加100 μL 于假單胞桿菌菌液中時，可促進假單胞桿菌的生長，且其促進作用顯著高于僅加入Bfr 蛋白時對假單胞桿菌生長的影響（圖5）。

圖5 不同時點假單胞桿菌OD600Fig.5 Pseudomonas spp.OD600 values in different time

3 討論

轉鐵蛋白（Tf）由N 端和C 端兩個結構域組成，并由中間的短鏈接區連接，兩個結構域具有非常高的同源性，每個結構域都能結合一個金屬離子[17]。Tf的主要作用是將鐵離子安全地運送到身體各處，為生長中的細胞提供所需的鐵元素[18]。本實驗克隆了黃鱔血清Tf 基因，序列分析表明，黃鱔Tf 基因和其他脊椎動物一樣具有N 端和C 端2 個結構域，并與其他魚類Tf 基因有較高的同源性。在此基礎上，筆者利用黃鱔Tf 基因N 端序列構建了表達載體，誘導純化了33 kD 的重組蛋白Tf-N，為進一步探究黃鱔轉鐵蛋白抑菌等功能奠定基礎。

鐵是生物體內含量最豐富的過渡金屬，大多數生物體使用鐵作為多種代謝酶的重要輔因子，而鐵在富氧條件下也會產生毒性，因而精確地維持鐵的穩態對于細菌的生存是必要的[19]。對于宿主而言，控制病原菌對自身鐵的利用是抵抗病原菌侵染的有效途徑之一[20]。本研究結果表明，Tf-N 蛋白可以抑制假單胞桿菌的生長，同時EDTA 對假單胞桿菌的生長也有抑制作用。EDTA 可以和幾乎所有的過渡金屬離子生成穩定的水溶性螯合物，通過螯合金屬離子，破壞細菌維持生存所需的金屬環境穩態[21]。本研究證實了只采用黃鱔血清Tf 基因N 端序列重組表達的蛋白仍然具有抑菌作用，推測Tf-N 蛋白的抑菌作用來源于其螯合鐵特性，Tf-N 蛋白通過結合鐵離子并打破細菌的鐵穩態，從而抑制細菌的生長繁殖。

Bfr 是細菌體內重要的儲鐵蛋白，在鐵過量條件下結合Fe3+從而維持細菌細胞質的鐵穩態[22]。本研究發現，單獨外源性添加Tf-N 蛋白對假單胞桿菌的生長有抑制作用，而將Bfr 蛋白與Tf-N 蛋白等濃度加入假單胞桿菌中時，可促進假單胞桿菌的生長，且其促進作用顯著高于僅加入Bfr 時對假單胞桿菌生長的影響。我們推測，在鐵過量條件下，宿主利用Tf-N 蛋白鐵螯合特性達到抑制細菌生長的目的[11]，而細菌體內特有的Bfr 通過與Tf-N 蛋白相互作用，利用Tf-N 蛋白的鐵結合能力，達到結合過量Fe3+維持細菌細胞質鐵穩態的目的，從而促進細菌的生長。Tf 和Bfr 的相互作用，以及Tf 的抗菌機理仍需進一步的探索與驗證。