抗生素及其抗性基因在水產養殖環境中的污染與消除技術研究進展

張羨宇，馬鵬飛，李娜，張鶯臍，張倩，劉鷹

（1.大連海洋大學海洋科技與環境學院，遼寧 大連 116023；2.大連海洋大學設施漁業教育部重點實驗室，遼寧 大連 116023）

抗生素作為一類抗菌劑被廣泛應用于人和動物的細菌性疾病的治療，在畜牧業和水產養殖業曾作為飼料添加劑以促進養殖生物生長和病害防控。然而，抗生素的吸收利用率較低，70%的抗生素隨著機體的代謝排放，最終進入水環境[1]。水環境中抗生素殘留會導致細菌產生耐藥性，形成抗生素抗性菌（Antibiotic resistance bacteria,ARB）和抗生素抗性基因（Antibiotic resistance genes,ARGs），可能會加速產生超級細菌，嚴重威脅公共健康安全[2]。此外，環境中“假持久性”殘留的抗生素可能會對一些非靶標生物產生毒性作用，長期低濃度抗生素暴露還可能會引起一系列遺傳毒性效應[3]。目前，抗生素及抗性基因在水產養殖環境中的污染現象較為普遍，亟待提升對抗生素及抗性基因潛在風險的認識及排放監管力度。綜上，本文通過綜述了近年來在水產養殖環境中抗生素和抗性基因的污染現狀，總結現有消除技術的應用情況及限制性，以期為制定養殖尾水排放標準提供支撐。

1 抗生素和抗性基因在水產養殖環境中的污染現狀

1.1 水產養殖環境中抗生素的來源與歸趨

中國是世界上最大的水產養殖生產國，占全球供應量的71%，也是全球最大的抗生素生產國和使用國[4]。在畜禽及水產養殖活動中，抗生素常被用于疾病的預防治療或作為飼料添加劑用于促進養殖生物生長，然而僅有20%～30%的抗生素被吸收利用，其余的抗生素隨著食物殘渣和糞便排放，最終進入水環境[5]，因此水產和畜禽養殖業被認為是環境中抗生素的主要來源之一。此外，生活及醫療廢水中也殘留較高水平的抗生素。污水處理廠對水體中有機污染物的處理效率較為有限，含有抗生素的廢水會被排放進入近岸海域，或轉移進入地下水、地表水，甚至是飲用水中[6]。污水處理廠的出水也被認為是水環境中抗生素的主要來源之一。Zhang等[7]對2013 年中國抗生素的使用及排放的調查結果顯示，我國常用的36 種抗生素的總使用量為9.27 萬t，約有5.38 萬t 被排放到環境中，其中，海河和珠江流域抗生素預測環境濃度值最高，單位面積的排放量每年平均超過79.3 kg/km2。在水產養殖區附近的河流、湖泊、近岸海域及沉積物中均檢測到多種抗生素（表1）。

表1 抗生素的檢出種類及含量Table 1 Types and contents of the detected antibiotics

抗生素進入水環境后易被吸附并蓄積在沉積物中，較難降解[15]，成為抗生素的“儲存庫”，養殖區沉積物中的抗生素水平往往高于其在水體中的濃度[16]。殘留的抗生素一部分會溶解于水體中，一部分沉積在底泥中，另一部分被水生動物吸收。水產養殖區域附近的水源通常僅經過簡單沉淀過濾處理便直接用于養殖生產活動。養殖水環境中殘留的抗生素會在養殖生物體內不同組織中富集，引起養殖蝦類和魚類體內抗生素殘留超標，使得我國水產品進入歐盟、日本、韓國等國市場受阻，嚴重影響我國水產品出口貿易，造成嚴重經濟損失。近些年，我國養殖水產品中先后出現了氯霉素、環丙沙星、孔雀石綠和硝基呋喃等抗生素類藥物殘留事件，養殖水產品的質量安全受到廣泛關注[17]。

1.2 水產養殖環境中抗生素殘留的生態風險

抗生素隨廢水排放等途徑不斷進入養殖水環境，導致其在環境中呈“假持久性”存在，水生生物長時間暴露在受抗生素污染的環境存在較高的生態風險和健康風險?？股貢诓煌瑺I養級的生物體內積累，且部分抗生素沿食物鏈傳遞具有生物放大的風險。在萊州灣近岸區域由19 種海洋生物構成的食物網中多種磺胺類抗生素發生了生物放大效應，營養級放大因子為1.4～3.9[18]?？股貧埩暨€可能會對養殖環境中非標靶生物產生毒性效應，包括藻類、浮游動物及發育早期的養殖生物等。上海市水環境中常被檢出的3 種持久性殘留抗生素（磺胺甲惡唑、土霉素和氟苯尼考）對小球藻（Chlorella pyrenoidosa）、費氏弧菌（Vibrio fischeri）、大型溞（Daphnia magna）和斑馬魚（Danio rerio）胚胎4 個營養級生物的毒性試驗及生態風險評價結果顯示，土霉素對4 種模式生物均表現出較高的毒性作用[19]。然而，在實際養殖水環境中不僅存在某單一種類的抗生素，多種抗生素共存可能會對水生生物產生相加，甚至協同的毒性作用。紅霉素、恩諾沙星、磺胺甲惡唑三種抗生素兩兩聯合使用對普通小球藻（Chlorella vulgaris）96 h 的急性毒性實驗均表現出協同作用[20]。水生態系統中的初級生產者對抗生素敏感性較高，低濃度抗生素持久性存在可能會引起水體中浮游植物的大量生長，包括東海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）、球形棕囊藻（Phaeocystis globosa Scherffel）和尖刺擬菱形藻（Pseudonitzschia pungens）等赤潮藻類，可能會對生態環境產生一定的影響[21,22]。抗生素殘留也會改變養殖水體中細菌群落結構組成，干擾多種微生物功能，影響水和土壤中微生物氮轉化、有機物降解及營養循環，破壞水生態平衡[23]?？股貧埩暨€會誘導微生物產生抗性基因，甚至誘導產生耐藥性極強的超級細菌，在不同養殖環境介質及養殖生物體內傳播，極大威脅人類健康。

1.3 水產養殖中抗性基因的產生及污染現狀

抗生素殘留不斷對水環境中的微生物群落造成脅迫壓力[24]，直接導致抗性基因的產生和傳播。水產養殖中殘留的抗生素在水體中和沉積物中不斷積累，細菌微生物通過隨機染色體突變或水平基因轉移獲得抗生素抗性基因，導致水產養殖生產環境及其周邊區域的微生物耐藥性增加[25]。位于可移動遺傳元件上的基因片段可通過水平基因轉移的方式移動到其他微生物內，使得養殖環境中更多的微生物獲得抗性基因片段[26,27]，促進耐藥細菌的形成。這使得抗生素的有效作用劑量不斷提高，甚至在高出初始使用劑量5 倍的情況下仍無法取得令人滿意的治療效果。已有調查研究顯示，水產養殖區的水體和底泥以及養殖動物體內均檢測到多種抗性基因，包括養殖中常用抗生素種類的抗性基因，如四環素類抗性基因、磺胺類抗性基因和大環內酯類抗性基因等。水產動物源常見的病原菌如副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、梅氏弧菌（Vibrio metschnikovii）等在水產養殖環境及腸道微生物中常被檢測到以質粒的形式攜帶多種抗性基因（表2）。

表2 水產養殖區抗性基因的污染情況Tab.2 Contamination of antibiotic resistance genes in aquaculture areas

抗性基因的種類和豐度與養殖模式、種類和密度密切相關。在中國水產養殖場中檢出的抗性基因種類比國外更豐富。在天津水產養殖場中的檢出的抗性基因中，磺胺類抗性基因最為普遍，相對豐度最高（3.0×10-5～3.3×10-4sul1/16S rDNA、2.0×10-4～1.8×10-3sul2/16S rDNA）[45]。在廣東省3 個畜禽水產綜合養殖場，水和沉積物中均存在多種抗性基因，均檢出四環素類（tetA 和tetM）和磺胺類抗性基因（sul1 和sul2）[46]。在大連莊河地區的養殖池塘及網箱養殖區中均檢測到磺胺類、四環素類、大環內酯類、喹諾酮類和氯霉素類抗性基因[35]。然而，許多研究表明：在一些未使用過抗生素的水產養殖環境和其他使用過抗生素的畜牧養殖環境中也檢測到了抗性基因的存在和傳播[47]。在未投加抗生素的工廠化循環水養殖系統中，抗性基因的豐度由養殖動物、糞便、飼料以及處理單元的選擇作用共同決定[34]。多項調查研究提示，水產養殖活動造成了多種抗生素和抗性基因的污染，攜帶抗性基因的抗性菌可通過水平轉移的方式在水環境中傳播，對全球公共健康和生態安全存在較大的風險。

2 水產養殖環境中抗生素和抗性基因的消除技術

目前，我國水產養殖環境中抗生素及抗性基因檢出頻繁且種類較多，但并未有專門針對抗生素及抗性基因的監測及相關的管控。許多研究關注污水處理廠中抗生素及抗性基因的去除特性，而對于水產養殖環境中抗生素及抗性基因污染的研究還較少。本文評價了水產養殖中常用的幾種消毒方式對抗生素及抗性基因的消除效果。

2.1 氯化消毒技術

氯化消毒通常以游離氯和二氧化氯為消毒劑消除污染物，因其成本較低在全球水處理領域被廣泛應用，也是水產養殖源水處理的重要消毒方式[48]。研究表明，游離氯濃度為5 mg/L、10 mg/L 和15 mg/L 時可完全去除城市污水環境中的青霉素、四環素等污染物[49]。氯化消毒主要依賴產生的游離氯，所以pH 是氯化消毒的關鍵因素，大多抗生素在pH5.5～8.5 之間去除效率較好[50]。抗生素的種類也會影響氯化消毒的效率，陰離子類抗生素比陽離子類抗生素的去除效率更高[51]。然而，氯化消毒可能會產生毒性較強的消毒副產物。喹諾酮氯化后對發光菌的毒性作用增強，四環素氯化后也會生成毒性較強的消毒副產物[52,53]。氯化消毒是水產養殖中最常用的滅菌方法，其成本低、應用廣，對細菌的殺滅率高。游離氯直接作用于細菌細胞外膜的蛋白質或肽聚糖，使細胞內大分子泄漏而滅活細菌[54]。游離氯液可作用于細胞質內的目標成分（如DNA、RNA、酶），造成抗性基因片段的裂解[55]。然而，由于實驗條件的差異，氯化對尾水中抗性基因的去除作用相差較大。對282 種抗性基因和13 種可移動遺傳元件進行氯化消毒處理結果顯示，4 mg Cl2/L 的游離氯消毒處理30 min，多種抗性基因和可移動遺傳元件均顯示出較高的去除率[56]。但也有研究表明，在15 mg Cl2·min/L 條件下對四環素類抗性基因和紅霉素類抗性基因無顯著去除作用[57]。即使將游離氯濃度提高到300 mg Cl2·min/L，與原始氯濃度相比，抗性基因的含量也沒有顯著降低[58]。還有報道顯示：氯化消毒可能會促進抗性基因的發生[59]。養殖水環境中殘留游離氯可能危害養殖生物[60]。因此，水產養殖環境中氯化消毒是否有助于去除抗生素和抗性基因還需更深入的研究。

2.2 紫外線消毒技術

紫外線消毒技術效果好、使用方便、無需額外添加化學物質而被廣泛應用于水處理中[61]。抗生素分子吸收光能后變成激發態從引發各種反應，可通過直接光解、間接光解和自敏化光解等方式被去除[62]。大量研究表明：紫外線（UV）輻照可有效地去除水溶液中的抗生素，尤其是對于較難被降解的抗生素去除效果顯著[63]。在避光條件下放置50 d，氟苯尼考濃度僅減少2%～7%，在模擬日光照射下氟苯尼考也不會發生光降解反應，而在UV（λ>200 nm）照射下其半衰期僅為（16±3）min[64]。UV 輻照不僅能分解多種抗生素，且在廢水處理中不易受到其他有機物的影響[65]。UV 光解實驗中顯示，UV 可高效降解內酰胺類、氟喹諾酮類和四環素類[63]。較多研究開始關注UV 與催化劑聯用對水中污染物的去除。

UV 消除微生物分為直接和間接兩種機制，直接機制是UV 可穿透細胞壁、細胞膜和細胞質直接被核酸吸收；間接機制指細胞內外的光敏物質吸收紫外光產生活性氧（ROS）氧化細胞膜、蛋白質、核酸和其他細胞物質而殺滅細菌[66]。理論上UV 消毒是一種去除抗性基因可行的方法。UV 可以高效滅活包括抗性細菌在內的細菌，降低水體中微生物的含量[67]。據報道，經紫外線消毒處理后，廢水中的四環素類抗性細菌的數量從103copies/mL 顯著減少到102copies/mL[68]。當UV 照射劑量為40 mj/cm2時，四環素類抗性基因去除率為52%～73.5%；當UV 照射劑量達到80 mj/cm2時，可以完全殺滅抗性細菌；當UV 照射劑量升高到160 mj/cm2時，對抗性基因的去除率提高到79.7%～92%[69]。UV 輻照可有效去除可移動遺傳元件的含量，有效控制抗性基因的水平轉移。但與此同時，越來越多的證據表明，UV 消毒在實踐中不如預期。在實驗室條件下，抗性基因mecA、vanA、tetA 和ampC 減 少3～4 log 需 要200～400 mj/cm2的紫外線劑量[70]，而在污水處理廠廢水處理的實際應用中，UV 輻照幾乎不能去除廢水中tetM、tetO、tetQ、tetW、sul1、sul2 和intl1 等抗性基因[68,71]。這可能因為實驗室所用的UV 輻照劑量較高，顯著高于國內外消毒標準中所推薦的輻照劑量（80 mj/cm2）[72]。同時，實地應用中養殖水的渾濁程度、水體流速等因素，也會影響UV 對抗性基因去除的效果。由于光活化和暗修復機制的存在，當UV 去除微生物后還會產生復活現象[73-75]。因此，UV 輻照對水產養殖環境中的抗性基因去除效果仍需實地檢測及評價。

2.3 臭氧消毒技術

臭氧是一種強氧化劑，通過直接氧化的形式與有機物迅速反應，也可與水基質生羥基自由基（·OH）間接地氧化大多數有機化合物。在阿莫西林、強力霉素、環丙沙星和磺胺嘧啶溶液中，隨通入臭氧濃度持續升高，去除率增加，75 mg/L 的臭氧可去除95%的抗生素，且其分解副產物沒有抗菌活性和毒性[76]。臭氧消毒的效率主要取決于臭氧劑量和暴露時間。當臭氧劑量達到125 mg O3/g DOC 且水力停留40 min 時，可完全去除8 種抗生素。當臭氧濃度為657 mg/L 水體停留時間為120 min 時，土霉素去除率可達96%，化學需氧量COD 和生化需氧量BOD 的去除效率分別為29%和33%[77]。然而，廢水中的有機物質可能與臭氧直接進行反應，因此會造成抗生素的去除效率降低[78,79]。與UV 消毒相比，雖然臭氧對抗生素的去除效率高，但容易產生臭氧副產物（包括溴酸鹽、氮氧化物）在養殖水體中大量積累，可能會對養殖對象甚至人體產生危害。

臭氧及·OH 會氧化破壞細菌細胞膜，然后直接破壞細菌的細胞器和DNA、RNA 等[80]。臭氧消毒對多種抗性細菌明顯的殺滅作用，大腸桿菌（Escherichia coli）、葡萄球菌（Staphylococcus）和腸球菌（Enterococcus）在與0.73 mg O3/mg DOC 接觸20 min后豐度直線下降[81]。經（0.9±0.1）g O3/g DOC 臭氧處理后，腸球菌、葡萄球菌、腸桿菌和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）等抗性細菌的殺滅率為60.2%～98.9%不等，而抗性基因blaVIM、vanA、ampC和ermB 的豐度分別降低了18.7%、49.9%、69.8%和99.3%。臭氧處理對抗性基因和抗性細菌呈現不同的耐受比，可能與抗性細菌對臭氧的耐受程度不同有關[82]。與UV 消毒和氯化消毒相比，臭氧消毒對抗性細菌和抗性基因的消除能力更強[83]，這可能是由于細胞膜破損及蛋白質泄漏時，微生物的基因片段直接暴露在臭氧之中。然而，臭氧消毒在黑暗條件下也存在再生和活化現象[74]。

2.4 高級氧化技術

高級氧化工藝的特點是在特定反應條件下產生和使用·OH，將化學污染物、細菌、病毒等氧化和殺滅[84-86]。目前，常見的高級氧化技術包括光催化、芬頓反應等。光催化氧化對抗生素和抗性基因去除率較高，為高級氧化技術中最常用的方法。UV 輻照劑量為18.9 mj/cm2和40 mg/L 的H2O2聯用，可完全降解氨芐西林、紅霉素和四環素等物質[87]。對某城市廢水中抗生素及其轉化產物的消除研究發現，當UV 輻照劑量達到0.9 kJ/L，照射90 min 時，可完全去除廢水中抗生素物質。當UV 與H2O2/Fe 聯合使用，可在30 min 內完全去除抗生素。添加低劑量的過硫酸鹽處理更有效，可在7～18 s 完全去除抗生素[88]。在過氧化氫濃度為0.01 mol/L 的條件下，UV/H2O2協同作用30 min 可使抗性基因豐度降低2.8～3.5 log，而UV 消毒和氯消毒僅能減少抗性基因豐度0.80～1.21 log 和1.65～2.28 log[89,90]。盡管研究結果表明UV/H2O2處理對抗性細菌和抗性基因有較高的去除效率，但對懸浮液中游離抗性基因的去除效果并不明顯[91]。這可能是由于氧化劑的劑量低或者是由于·OH 與其他胞內物質反應無法作用于DNA 片段上[92,93]。與其他消毒方式相比，高級氧化技術對抗生素去除、抗性菌殺滅和抗性基因去除等效果良好，但需額外添加催化劑，成本高于紫外和氯化等消毒技術。

除此之外，水產養殖中常用的水處理方法還包括物理過濾、生物濾器、活性污泥及人工濕地等。利用物理法可能只會去除部分吸附于固體顆粒物上的抗生素和抗性基因，并不能從本質上去除水體中的抗生素和抗性基因，只是改變其存在位置。利用生物法處理養殖廢水，抗生素可能會抑制微生物的活性，影響其水處理效能。在大規模廢水處理廠中，蛋白桿菌、霉菌和活性桿菌等細菌（1.0%～8.2%）在活性污泥處理后并未被消除，反而促進了質粒在細菌間的轉移[94,95]?；钚晕勰嘀形⑸锶郝涞拿芏群投鄻有暂^高，大量營養物質為微生物的生長提供環境，容易導致基因水平轉移，甚至出現多重耐藥基因。相較于臭氧等消毒工藝，生物法處理效果較慢且存在較高風險[96]。

3 未來及展望

抗生素及抗生素抗性基因在水產養殖環境中的頻繁檢出，嚴重影響我國水產養殖業。然而，因尚未有適用的測定方法，抗生素及抗性基因暫時并未列入養殖尾水排放的監管范圍。目前研究熱點主要集中在不同處理工藝對污水處理系統中抗生素和抗性基因的去除作用，而對于作為抗生素和抗性基因儲存庫的水產養殖環境相關的研究還較少。目前，水產養殖水處理過程中常用的幾種處理方法對抗生素和抗性基因表現出不同程度的去除效果，但也存在較多問題。未來研究應立足于水產養殖，優化升級現有的消毒方式，以實現對抗生素和抗性基因的完全消除或阻止其發生轉移。因此，今后相關科研應聚焦于以下幾點:

（1）重視水產養殖中抗生素和抗生素抗性基因的污染問題，加強對養殖過程中抗生素使用的監管，避免由此帶來的抗性基因污染及耐藥性的產生

（2）加強多種消毒方式聯用的研究。單一消毒方不能完全礦化或完全殺滅對抗生素及其抗性細菌的問題，而增大處理劑量可能會產生有毒副產物，多種消毒方式聯用去除抗生素和抗性基因更加高效，如UV/H2O2、紫外光芬頓等。

（3）關注消毒過程中消毒副產物的生成。臭氧消毒方式可高效去除抗生素及抗性基因，但容易產生消毒副產物，UV 光解抗生素也可能生成毒性更高的中間產物，從而對養殖環境中其他生物產生毒害作用。