超高效液相色譜串聯質譜法測定漁業(yè)水環(huán)境中七種氟喹諾酮類藥物含量

高磊，王鐘強，覃東立，陳中祥，吳松，湯施展，黃曉麗，孫承宇，黃麗,6，郝其睿，白淑艷，杜寧寧，李晨輝，王鵬

（1.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，黑龍江 哈爾濱 150070；2.農業(yè)農村部漁業(yè)環(huán)境及水產品質量監(jiān)督檢驗測試中心（哈爾濱），黑龍江 哈爾濱 150070;3.農業(yè)農村部水產品質量安全控制重點實驗室，北京 100141;4.河北省水產技術推廣總站，河北 石家莊 050021；5.東北農業(yè)大學，黑龍江 哈爾濱 150030;6.東北林業(yè)大學，黑龍江 哈爾濱 150006）

近年來隨著我國養(yǎng)殖行業(yè)的迅猛發(fā)展，抗生素藥物的使用規(guī)模也在隨之增加[1]。氟喹諾酮類藥物（FQs）對水產養(yǎng)殖中革蘭氏陰性菌包括綠膿桿菌等，革蘭氏陽性菌包括鏈球菌、葡萄球菌等均有較強活性[2]，具有高效、廣譜、價格低廉、抗菌譜廣等諸多優(yōu)點[3]，目前已成為使用量較大的抗生素藥物之一[4]。然而FQs 卻難以被生物吸收或代謝，在自然界不易降解[5]。據研究表明，FQs 被動物體吸收后，僅有少部分的FQs 會殘留在動物組織內，大部分會通過糞便或尿液等途徑排出體外，最終進入到生態(tài)環(huán)境中，造成抗生素藥物污染[6,7]。并且原藥及其代謝產物會隨食物鏈不斷富集，最終影響與危害人體健康。綜上所述，建立一種快速準確高效的檢測漁業(yè)水環(huán)境中的FQs 殘留的方法是十分有意義的。

固相萃取（SPE）因富集能力優(yōu)良而被應用于不同的前處理過程[8,9]，但由于部分商業(yè)化固相萃取小柱的價格其應用受到相應的限制。磁性固相萃取（magnetic SPE，MSPE）是一種新型固相萃取技術，其采用磁性材料作為吸附載體，原理是將磁性吸附材料直接與待測樣品溶液混合，通過振蕩吸附等手段使得吸附材料和待測物充分接觸并達到動態(tài)吸附平衡狀態(tài)，再通過外部磁場作用將吸附了待測物的吸附材料與基質分離開，再采取洗脫等步驟解析待測物，達到富集目標待測物的目的。MSPE 技術萃取效率高、步驟簡單、價格低廉、可批量處理大批次樣品及可回收利用多次，已成為當前環(huán)境及食品安全等多個學科的研究熱點如甘藍中農藥檢測[10]，蜂蜜[11]、動物組織[12]和人體血液[13]中抗生素藥物的檢測等。

常用儀器檢測法檢測抗生素的殘留量，如高效液相色譜（HPLC）法[14-17]和液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）法[18-20]等。由于HPLC 法的定性手段為保留時間，當基質相對復雜時會由于待測物與雜質同流出導致目標定性不準確，造成假陽性。而采用了三重四極桿質譜的多反應監(jiān)測模式的LC-MS/MS法不僅僅通過保留時間，結合兩對離子對及其比例，可以實現更準確的定性，還具有更高的準確度以及靈敏度，能夠滿足水環(huán)境中痕量抗生素藥物殘留檢測的要求，目前為多組分檢測的主要分析手段[21-24]。

本研究擬開發(fā)一種磁性萃取技術，以快速、準確檢測養(yǎng)殖水體中FQs 的殘留。選用碳納米管作為載體，使用制備后具磁性的碳納米管（MCNTs）作為漁業(yè)水環(huán)境中FQs 的吸附材料，結合超高效液相色譜串聯質譜法，建立漁業(yè)水環(huán)境中多種FQs 的分離方法，最終建立水體中FQs 的殘留檢測方法。本方法具有靈敏度高、實驗成本低、可同步批量檢測等優(yōu)點。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜-串聯質譜儀（ACQUITY UPLC-XEVO TQs，含ESI 電離源，美國Waters 公司）；空氣壓縮機（日立公司）；氮氣發(fā)生器（PEAK 公司）；氮吹儀（N-EVAPTM111，美國Organomation 公司）；超聲波清洗機（KQ-700E，昆山超聲儀器有限公司）；純水器（美國Millipore 公司）；渦旋混勻器（德國IKA 公司）；水浴鍋；烘箱等。乙腈、乙醇、甲酸、碳納米管（CNTs）、甲醇、氯化鐵、氯化亞鐵及氨水等試劑耗材購置于上海安譜實驗室。

1.2 標準溶液配置

恩諾沙星（EFX）、環(huán)丙沙星（CFX），諾氟沙星（NFX）、培氟沙星（PEF）、洛美沙星（LOM）、氧氟沙星（OFX）、氟羅沙星（FLX）及三種內標NFX-D5、CFX-D8、EFX-D5 抗生素藥物標準品均購自德國Dr.Ehrenstorfer 公司。準確稱取一定量（10 mg）各標準品，加入甲酸0.2 mL，再加入甲醇超聲溶解，定容于10 mL 容量瓶中，配制成1 mg/mL 的FQs 單標儲備溶液，于-18℃保存。儲備液用甲醇稀釋，配制成各濃度的混合標準工作溶液，于4℃保存，現用現配。

1.3 樣品前處理

磁性碳納米管（MCNTs）根據本課題組已建立的合成方法做適當修改[25]。首先將CNTs 進行純化，洗滌。進一步采用二價鐵，三價鐵在堿性條件下合成MCNTs。再經超純水，無水乙醇分別清洗，烘干備用。取100 mL 水樣過濾紙，收集濾液置于250 mL燒杯中。首先使用冰醋酸或氨水將過濾好的水樣pH 調節(jié)到7，然后加入MCNTs 30 mg，渦旋30 s，振蕩提取20 min。超強磁鐵將MCNTs 吸附至底層，棄掉上層水樣，而后每次使用1 mL 甲醇洗脫MCNTs，共計三次，磁性分離洗脫液，將洗脫液置于40℃下氮氣吹至近干，加入1 mL 液相色譜初始流動相后渦旋30 s 混勻，過0.22 μm 有機相過濾膜得到上機液。

1.4 色譜質譜儀器條件

色譜相關條件如下：流速為0.3 mL/min；流動相A 為甲酸水溶液（V甲酸∶V水=1∶1000），流動相B 為乙腈；洗脫梯度程序為：0～2.0 min（保持95%A，5%B）；2.0～4.2 min（95%～5%A，5%～95%B）；4.2～6.4 min（保持5%A，95%B）；6.4～6.5 min（5%～95%A，95%～5%B）；6.5～8.0 min（保持95%A～5%B），其中流動相A 為0.1%甲酸水溶液（V甲酸∶V水=1∶1 000），流動相B 為乙腈。色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH C18，1.7 μm，2.1×50.0 mm；柱溫為30℃。

質譜相關條件如下：電噴霧離子源（ESI+）；毛細管電壓，3.0 kV；離子源溫度，150℃；去溶劑溫度，450℃；偏轉電壓，30 V；去溶劑氣流量，800 L/Hr；錐孔氣，250 L/Hr；錐孔電壓，20 V；碰撞氣流量，0.14mL/min；選擇多反應監(jiān)測（MRM）；FQs 的多反應監(jiān)測模式各參數如表1 所示。以保留時間、離子對及離子對豐度比定性。定量采取內標法定量，其中NFX、OFX、FLX、PEF 選用NFX-D5 定量，CFX、LOM選取CFX-D8 定量，EFX 選取EFX-D5 定量。

表1 多反應監(jiān)測模式下7 種FQs 的質譜參數Tab.1 Mass spectrometry parameters of seven fluoroquinolone antibiotics in multiple reaction monitoring mode

2 結果與分析

2.1 儀器分析條件的優(yōu)化及確定

根據經典的色譜塔板理論，使用1.7 μm 粒徑的5 cm 超高效液相色譜柱，相同長度的色譜柱會比傳統的HPLC 有更好的柱效，并且在更短的時間內完成多組分物質的分離，得到更尖銳的色譜峰。優(yōu)化LC-MS/MS 的MRM 方法和7 種氟喹諾酮類抗生素的質譜條件。配置每種FQs 物質標準品的單標溶液，采用Combine 方式得到其母離子及子離子的質核比。進一步優(yōu)化碰撞能量等質譜參數。在MS SCAN 模式下得到待測物的母離子，然后在Daughter 模式下掃描得到相應子離子，找到兩個豐度最高的子離子，其中一個母離子和一個子離子組成一對特征離子對。根據歐盟對化合物的定性要求，一般定性采用兩對特征離子對，其中一對作為定量離子。為達到質譜的最佳靈敏度通過Combine 模式優(yōu)化碰撞能量，以不同的碰撞能量掃描目標物的子離子，根據其強度的響應變化，得到最大響應值時的儀器參數。

2.2 萃取條件的優(yōu)化

2.2.1 MCNTs 質量對回收率的影響

影響萃取最終回收率效率的因素有很多，其中MCNTs 的質量是關鍵因素之一。本實驗在100 mL水樣中分別加入10 mg、20 mg、30 mg、40 mg、50 mg磁性材料，每個實驗組3 次平行，取平均值作圖（圖1-A），當MCNTs 添加量小于30 mg 時，7 種FQs 回收率同MCNTs 添加量成正相關；當添加量大于30 mg 后，FQs 回收率趨于穩(wěn)定。因此最終選擇向100 mL 水樣中添加30 mg MCNTs 最為最優(yōu)條件。

2.2.2 萃取時間的優(yōu)化

在磁性固相萃取的諸多影響因素中，萃取時間對萃取效果的影響較為關鍵。此次實驗考察了5 min、10 min、20 min、30 min、40 min 等不同萃取條件下回收率的變化規(guī)律，每個實驗組做3 次平行試驗，取平均值作圖（圖1-B），當萃取時間小于20 min時，吸附效果與萃取時間呈正相關，回收率提高；當萃取時間大于20 min 時，回收率變化不大，說明已達到萃取飽和狀態(tài)。因此實驗最終選擇20 min 作為萃取時間。

圖1 萃取劑添加量（A）、萃取時間（B）及使用次數（C）對FQs 回收率的影響Fig.1 The influence of amount of extractant（A）,extraction time（B）and frequency of use（C）on recovery of the fluoroquinolone antibiotics

2.2.3 洗脫劑的選擇

本實驗選取丙酮、甲醇和乙腈三種洗脫溶劑進行測試[25]。超聲洗脫相對于渦旋洗脫會有更高的洗脫效率，選用3 mL 丙酮、3 mL 甲醇、3 mL 乙腈分別作為洗脫劑洗脫一次（超聲30 s），發(fā)現甲醇洗脫劑洗脫效果良好，價格較低。另外，選取合適的洗脫體積會減少后續(xù)氮氣吹干所需的時間，實驗選用了1 mL、3 mL 及5 mL 等不同體積的洗脫劑進行實驗，結果表明當洗脫劑為1 mL 甲醇，每次超聲30 s，重復上述操作2 次，每個組份的回收率均可以達到80%以上。故最終選取甲醇1 mL 作為洗脫劑。

2.2.4 MCNTs 的重復使用

磁性分離后，將MCNTs 回收，重新干燥待用。并重新使用回收干燥后的MCNTs 作為吸附材料重新處理樣品，并在最優(yōu)條件下測定其回收率，每個實驗組做3 次平行試驗，取平均值作圖（圖1-C），使用MCNTs 第3 次時，待測物回收率依然可以達到75.67%以上。故此吸附材料可重復使用至少2 次。

2.3 方法線性范圍及檢出限

分別配制不同濃度梯度的FQs 標準溶液100 mL，按照上述優(yōu)化后得到的最佳前處理條件凈化富集樣品，最后采用UPLC-MS/MS 定性定量分析。結果顯示，在樣品質量濃度在20～1 000 ng/L 范圍時得到了很好的線性，其相關系數r 均在0.995～1 之間，檢出限為10.0 ng/L。為了考察方法的準確性，選取了低濃度（10 ng/L）、中濃度（100 ng/L）和高濃度（1 000 ng/L）3 個不同濃度對質控樣品進行加標回收實驗，且每個濃度做三次平行試驗，以純凈水的加標回收率進行校正，測定加標回收率，將高濃度質控樣品連續(xù)處理三天計算回收率以得到日間精密度。七種FQs 的回收率均在76.70%～98.16%之間，日內精密度在2.21%～5.39%之間，日間精密度在3.48%～6.21%之間（表2）。

表2 七種FQs 的加標回收率及精密度Tab.2 Recoveries and precision of the fluoroquinolone antibiotics in fishery water

2.4 實際樣品分析

實際水樣取自4 個位于哈爾濱周邊的養(yǎng)殖池塘（各1 個樣品）、哈爾濱市道里區(qū)室內自來水（1 個樣品）和某品牌瓶裝礦泉水（1 個樣品），共計6 個樣品。經上述前處理過程后分析，發(fā)現哈爾濱一處池塘有恩諾沙星（EFX）和環(huán)丙沙星（CFX）的殘留，其EFX 含量為90.62 ng/L，CFX 含量為27.51 ng/L（圖2）。

圖2 空白（A）、標準樣品（B）和實際樣品（C）色譜圖，其中箭頭指示部分為EFX 和CFX 的兩個定性離子對的放大色譜圖Fig.2 The total ion chromatogram of（A）the blank sample;（B）the standard fluoroquinolone antibiotics;and（C）one real sample,where the arrows indicated the extraction ion chromatogram

3 討論

本方法相比于采用商業(yè)固相萃取柱方式前處理樣品，可以降低實驗成本[23]。并且較先前課題組建立的篩查方法本研究得到了更好的定量限，使定量限進一步降低1.65 倍[26]。在儀器分析階段，采用液相色譜作為分離單元分離多組份時往往需需要20 min 以上；本研究采用超高效液相色譜可以將分析時間控制在8 min，縮短為分析時間一半以上，同時每分析一個樣品僅需要不到1.03 mL 有機流動相，每個樣品可減少消耗1.6 mL 有機溶劑[27]。在處理樣品時可以采用同步振蕩方式處理大批量漁業(yè)水環(huán)境樣品，提高檢測效率，具有操作簡單用時短、環(huán)保安全等優(yōu)點[25]。

綜上所述，本實驗建立了一種新型分離萃取漁水域中七種氟喹諾酮類藥物的M-SPE 方法，采用UPLC-MS/MS 對FQs 定性定量分析。針對色譜質譜條件、吸附材料的質量、萃取時間、洗脫劑的選擇等條件進行了優(yōu)化，所分析的諾氟沙星（NFX）、環(huán)丙沙星（CFX）、培氟沙星（PEF），洛美沙星（LOM）、恩諾沙星（EFX）、氧氟沙星（OFX）、氟羅沙星（FLX）七種FQs 在20～1 000 ng/L 表現出良好的線性，具有實驗成本低、檢測靈敏、儀器分析時間短、節(jié)約有機溶劑消耗及可批量處理等優(yōu)勢。未來亦可制作成商品化樣機，應用于實際漁業(yè)水環(huán)境樣品的現場處理，以解決現場快檢技術中樣品前處理的瓶頸，具有很好的應用前景。