六堡茶中具有膽汁酸結合能力的化學成分研究

陳 歡　滕建文　韋保耀　夏 寧　黃 麗　尹世磊

六堡茶中具有膽汁酸結合能力的化學成分研究

陳 歡滕建文韋保耀夏 寧黃 麗尹世磊

（廣西大學輕工與食品工程學院，廣西 南寧 530001）

以六堡成品茶為原料，采用溶劑提取法提取不同極性部分進行膽汁酸結合能力測試，并利用高效液相色譜法進行主要化學成分測定。最后用相關性分析找出具有膽汁酸結合能力的主要化學成分。通過對膽汁酸結合能力與特征物質、多酚與多糖含量的相關性分析發現六堡茶中具有結合膽汁酸能力的主要為酚類成分，除酯型兒茶素外，沒食子酸（GA）與總酚含量也與膽汁酸結合能力有較強相關關系，多糖也有一定的結合膽汁酸能力。

六堡茶；膽汁酸結合能力；降脂；酚類化合物

引言

茶葉中的化合物如茶多酚，能夠通過自身抗氧化能力或者改善機體內部的抗氧化系統來抵御脂質過氧化，從而預防心血管疾病。膽汁酸的生物合成為膽固醇的分解提供了一條重要的代謝途徑[1]。膽汁酸的肝腸循環中，在肝臟中由膽固醇合成的膽汁酸流入膽管進入腸道，95%的膽汁酸在回腸末端被重吸收經過門靜脈回流到肝臟，大部分膽汁酸可被肝臟一次性吸收，這些在肝臟中被重新吸收的膽汁酸對膽汁酸自身的合成起負反饋調節作用，同樣也對膽固醇的分解代謝起負反饋調節作用[2,3]。因此，茶葉中相關物質與膽汁酸結合，從而阻礙膽汁酸的重吸收，有利于降低機體膽固醇水平。

六堡茶是廣西梧州特有名茶。六堡茶是典型的黑茶之一，為國家地理標志保護產品，六堡茶因其獨特的風味和良好的保健功能受到消費者的喜愛。有研究報道，黑茶中的功能性成分在腸道內影響脂類的消化和吸收，有效地降低大鼠總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）以及低密度脂蛋白膽固醇含量（LDL-C），同時能顯著提高高密度脂蛋白膽固醇含量，達到降血脂的目的，其中六堡茶的效果特別明顯[4,5]。然而現在關于六堡茶降脂作用的成分并不明確，因此，研究根據六堡茶的膽汁酸結合能力來討論其降脂的功能成分值得探究，這對于六堡茶保健功能方面的發展與理論支撐具有重要意義。

綠茶屬于無發酵茶，而黑茶屬于后發酵茶。綠茶是現在被廣泛證明具有較強膽汁酸結合能力的物質[6]。與綠茶相比，黑茶茶多酚總量下降，但在體內仍表現出較高的膽汁酸結合能力[7]。發酵過程使黑茶各指標均產生了變化，黑茶中的茶多酚、兒茶素、茶黃素、茶紅素、氨基酸和可溶性糖的含量較發酵前的毛茶水平均大大降低；相反，茶褐素、多糖、不溶性多酚等含量明顯增加[8,9]。后發酵過程還增加了黑茶中的咖啡因含量[10]。這些物質的含量的變化也導致了其膽汁酸結合能力的變化。

黃麗[11]通過小鼠體內模型證明了六堡茶提取物能顯著降低血脂三項，其乙酸乙酯相和水萃余相活性進一步增強，都具有降低TC和TG，增加高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）的作用。吳正梅[12]通過模擬腸部消化，發現了在茶提取物中，綠茶、紅茶、六堡毛茶和六堡成品茶的膽汁酸結合量為17.92%～43.55%，六堡成品茶在結合膽汁酸能力、抗氧化能力及酶活性上強于毛茶。由于六堡茶是典型的黑茶之一，經過發酵后其成分發生了顯著的化學變化，六堡茶主要具有降低脂活性作用的物質是哪些值得進一步研究。但目前的研究沒有從六堡茶整體上，獲得不同極性部分，研究其膽汁酸結合能力大小，這對于六堡茶具有降脂產品的進一步提純與開發是不利的。

本研究以六堡成品茶為研究對象，采用溶劑提取法獲得有效活性部分，根據課題組前期對六堡茶中茶葉水提物的指紋圖研究中確定的沒食子酸（Gallic acid，GA）、沒食子兒茶素（Gallocatechin，GC）、原兒茶素、原花青素、咖啡堿、EGCG、沒食子基兒茶素沒食子酸酯（Gallocatechin gallate，GCG）和ECG 8個共有峰的基礎上[13]，確定六堡茶具有膽汁酸結合能力的主要物質基礎。以期為六堡茶后期活性物質的提取與功能性食品的開發提供進一步參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

六堡成品茶：由梧州中茶茶業有限公司提供。

標準品：GA，Gallic acid：沒食子酸；GC，(-)-gallocatechin：沒食子兒茶素； EGCG，(-)-epigallocatechin gallate：表沒食子兒茶素沒食子酸酯； GCG，(-)-Gallocatechin gallate：沒食子兒茶素沒食子酸酯；ECG，(-)-Epicatechin gallate：表兒茶素沒食子酸酯；Caffeine：咖啡堿；Protocatechuic acid：原兒茶素；Procyanidin：原花青素；葡萄糖。以上標準品均購于北京北京盈澤納新化工技術研究院。

其他試劑：乙二胺四乙酸（EDTA）；乙酸乙酯；氯仿；無水乙醇；福林酚；碳酸鈉；濃硫酸；苯酚；甘氨鵝膽酸；甘氨膽酸；甘氨脫氧膽酸；?；敲撗跄懰幔慌；蛆Z膽酸；磷酸緩沖液；考來烯胺；鹽酸；氫氧化鈉；胰酶，以上試劑均為分析純，購于中國國藥公司。超純水（美國Millipore 超純水機制備）。甲醇；乙腈；乙酸，以上試劑均為色譜純級別，采購自美國Thremo fisher公司。

主要儀器與設備：5694高效液相色譜儀-2998二極管陣列檢測器：配有Empower Pro數據處理系統，美國Waters公司。電熱恒溫水浴鍋 HHS：上海博訊實業有限公司。分析天平AL204：梅特勒托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 高效液相色譜檢測條件

高效液相色譜條件：液相柱為安捷倫 ZORBAX Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫設定為35℃。流動相A：分別將90 mL乙腈，20 mL乙酸，2 mL EDTA-2Na溶液（20 mg/mL）加入1000 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，過0.45 μm膜。流動相B：分別將800 mL乙腈，20 mL乙酸，2 mL EDTA-2Na溶液（20 mg/mL）加入1000 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，過0.45 μm膜。流動相的流動速率為1 mL/min。流動相的梯度為：0 min～10 min，A：100%；10 min～20 min，A：100%～68%，B：0%～32%，保持10 min。30 min～50 min，A：100%，用于沖洗。二極管陣列檢測器檢測條件：檢測波長設定為278 nm。

1.3　樣品的制備

參考張名娥等[14]的方法進行制備。茶葉水提液：茶葉樣品粉碎至40目顆粒大小。用天平稱量20.00 g樣品，加入200 mL蒸餾水，于沸水水浴浸提20 min，過濾，收集濾液。重復3次，合并濾液得到茶葉水提液。氯仿相：將茶葉水提液濃縮至200 mL左右并加入等體積氯仿進行萃取，重復操作至氯仿萃取相無色，收集合并氯仿萃取相并減壓濃縮干燥得到氯仿相樣品。乙酸乙酯相：將氯仿萃余相加入等體積的乙酸乙酯萃取，重復操作至乙酸乙酯萃取相恢復原來的色澤，收集合并乙酸乙酯萃取相并減壓濃縮得到乙酸乙酯相樣品。醇沉相：將乙酸乙酯萃余相繼續加入三倍體積的無水乙醇醇沉，過濾，收集沉淀物，真空冷凍干燥得到醇沉相樣品。水余相：將剩余醇沉相上清液濃縮冷凍干燥得水余相樣品。各相回收率與提取率計算方式為：回收率=溶劑提取干物質重量/茶葉水提液干物質總量×100%；提取率=溶劑提取干物質重量/提取茶樣質量×100%。

1.4　多酚含量測定

用不同濃度的沒食子酸（10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL）所對應的吸光度構建標準曲線（y= 0.0092x+0.0216，R2= 0.9983）。準確稱取0.10 g茶多酚樣品于燒杯中，加入不超過60℃的蒸餾水25 mL左右，充分溶解后冷卻定容至100 mL容量瓶中，即為1 mg/mL的母液，后續使用時稀釋成不同濃度（10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL、60 μg/mL）。1 mL樣品或標準品加入5 mL的10%福林酚試劑后，于3 min～8 min內加入4 mL 7.5%的碳酸鈉溶液混勻，反應60 min后，于765 nm處測定吸光值。所有樣品重復做三次平行試驗。

并按下式求出茶多酚含量：

式中，X：多酚含量（%）；E：根據試樣測得的吸光度，從標準曲線上查得的沒食子酸相應含量（μg/mL）；V：樣品溶液的體積（mL，本實驗中為100 mL）；D：測得吸光度前的稀釋因子（本實驗中稀釋因子為20）；M：樣品質量（g）；G：試樣水分（%）。

1.5　多糖含量測定

參考王黎明等[15]的方法。稱取20 mg、經105℃干燥至恒重的葡萄糖標準品, 定容至500 mL。配制成0.040 mg/mL 標準葡萄糖溶液。稱取6 g苯酚溶于100 mL容量瓶中配成0.06 g/mL的苯酚溶液。準備24只20 mL試管分成3組，分別加入蒸餾水和葡萄糖溶液配置成為不同濃度的葡萄糖溶液（10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL、60 μg/mL），然后在每只試管中加入0.06 g/mL的苯酚溶液1 mL，將各試管搖勻后, 每試管中加入5 mL 98%濃硫酸，靜置20 min后搖勻，40℃恒溫水浴15 min。490 nm處測定OD值，制作標準曲線（如表3所示）。所有樣品重復做三次平行試驗。

1.6　結合膽汁酸能力實驗

參考Kahlon等[16]的方法。膽汁酸混合液（36 mmol/L）由甘氨鵝膽酸（9 mmol/L）、甘氨膽酸（9 mmol/L）、甘氨脫氧膽酸（9 mmol/L）、?；敲撗跄懰幔?.5 mmol/L）和?；蛆Z膽酸（4.5 mmol/L）組成，均用pH 6.8 的磷酸鹽緩沖溶液進行配制，并于-20℃下儲備，使用時稀釋到0.72 mmol/L。

取5 mg樣品或5 mg考來烯胺，加入1 mL 0.01 mol/L的鹽酸溶液，在37℃下恒溫振蕩消化2 h。然后用0.02 mol/L的氫氧化鈉溶液調節pH值到7～7.5，隨后加入4 mL稀釋過的膽汁酸混合工作液和5 mL 10 mg/mL胰酶（用pH6.8的磷酸緩沖液進行配制），繼續在37℃下恒溫振蕩消化2小時后，在6000 r/min 轉速下離心20 min。最后測定上清液中的膽酸鹽的含量，即為未結合的膽汁酸含量。所有樣品重復做三次平行試驗。

1.7　數據分析

采用EXCEL2010、SPSS17.0、ORIGIN8.5軟件對數據進行處理和繪制；采用Empower pro軟件進行高效液相檢測結果的分析和標曲的構建。

2　結果與分析

2.1　六堡成品茶各組分的提取與組成分析

表1可知，乙酸乙酯相以多酚為主、醇沉相以多糖為主。乙酸乙酯相中的酚類含量高達55.69%，醇沉相的多糖類含量高達47.07%，遠遠高于其六堡成品茶本身（六堡成品茶水提液的多酚多糖含量分別為17.87%和3.32%），本次溶劑萃取法相對于原提取液的總回收率約為85%，說明本研究采用的提取方法有較好的提取效果，可以用于后續分析與進一步實驗。

表1　六堡成品茶各組分提取與含量情況

注：a～d：表示同一列數據中的顯著性差異（＜0.05）

2.2　六堡成品茶各提取物的體外膽汁酸結合能力

表2中可以看出茶葉水提液的膽汁酸結合能力為27.15%，而表中除了作為標準對照的考來烯胺外，具有最高膽汁酸結合能力是六堡茶乙酸乙酯相，它的膽汁酸結合能力為68.77%，說明所采用的溶劑提取法能夠將有效部分較好的提取出來。就膽汁酸結合能力的強弱比較：乙酸乙酯相＞茶葉水提液＞水余相＞醇沉相＞氯仿相。

表2　六堡成品茶各提取物的體外的膽汁酸結合能力

注：膽汁酸結合率（%）=5 mg樣品的結合量/空白對照中膽汁酸含量

2.3　標準曲線的構建與不同樣品中特征物質含量的分析

利用高效液相法對不同濃度的GA、GC、原兒茶素、原花青素、咖啡堿、EGCG、GCG與ECG的單標進行測定，構建了峰面積與含量的標準曲線。利用吸光光度法對不同濃度的多酚與多糖進行測定，構建了吸光度值與含量的標準曲線。其標準曲線與R2值如表3所示。可以看出這10種成分的標準曲線R2值均大于0.99，說明具有良好的線性關系，可以用于后續實驗的含量分析。

表3　特征物質、多酚與多糖的標準曲線的構建

為了進一步了解各相中的特征物質含量，分別取六堡茶氯仿相、乙酸乙酯相、醇沉相和水余相樣品進行高效液相色譜檢測。得到的結果如圖1與表4所示，圖1中可以看出各峰的分離度良好，基線較平穩，符合分析要求。從表4中可以發現，各相化學物質的組成與含量差別均較大。乙酸乙酯相與水余相的化學物質比其余相更加豐富，且乙酸乙酯相的總體含量水平明顯高于水余相；六堡茶氯仿相中以咖啡堿和GA為主；醇沉相中幾乎沒有六堡茶特征化學物質的存在。

圖注：a：氯仿相，b：乙酸乙酯相，c：醇沉相，d：水余相；1：GA，2：GC，3：原兒茶素，4：原花青素，5：咖啡堿，6：EGCG，7：GCG，8：ECG

表4　六堡成品茶氯仿相、乙酸乙酯相、醇沉相和水余相的特征物質含量

注：-，表示在高效液相色譜檢測條件下沒有檢出或低于檢出限。

2.4　特征物質含量與膽汁酸結合能力之間的相關關系

由表5可知，GA、EGCG、GCG、ECG為膽汁酸結合能力較強的共同物質，相關系數均在0.90以上，特別是GCG（相關系數0.945）與EGCG（相關系數0.936）具有顯著相關性。在這當中，僅有GA為非酯型兒茶素?？偠喾优c膽汁酸結合能力的相關性為0.917，證明總多酚含量與膽汁酸結合具有顯著相關性。此外，結合表2中的結果可以看出氯仿相、醇沉相和水余相也具有一定的膽汁酸結合能力。且乙醇相與水余相的膽汁酸結合能力比氯仿相更強，可能是因為乙醇相和水余相中含有較強膽汁酸結合能力的EGCG、GCG與ECG。而氯仿相的膽汁酸結合能力可能主要依賴于GA的存在。

表5　六堡成品茶中特征物質含量與膽汁酸結合能力之間的相關關系

注：*，在0.05 水平（雙側）上顯著相關。

3　討論

六堡茶具有獨特的渥堆發酵工藝，因其優良的風味和功效受到消費者喜愛，降脂作用是六堡茶具有的重要功能之一。已有的報道中，kahlon[16]采用類似的方法，研究了多種水果的膽汁酸結合能力，結果發現包括蘋果、菠蘿等多種水果在內的膽汁酸結合率在1%～7%之間，而茶葉的膽汁酸結合率可達到20.55%～36.5%。說明茶葉具有較高的降血脂開發價值，是潛在的保健食品。為了研究茶葉具有結合膽汁酸能力的主要成分物質，首先，采用溶劑提取法盡可能多的獲得有效活性成分。一般在茶葉提取物中，氯仿相主要含有咖啡堿等，乙酸乙酯相主要為多酚類等物質，醇沉相主要是多糖類等物質，水余相為極性類酚類等。通過各相提取的酚類和多糖的數據，也可以看出六堡茶各個部分提取的效果良好，滿足后續實驗的需要。

綠茶是具有較強的膽汁酸結合能力并且現在被廣泛研究的茶葉種類，六堡毛茶是未經過渥堆發酵的茶葉，它們常與六堡成品茶一起進行比較。在膽汁酸結合能力方面，Wu[7]的研究發現水提物的膽汁酸結合能力為綠茶（45.83%）＞六堡成品茶（26.03%）＞六堡毛茶（18.86%）；Qin[9]研究了六堡成品茶水提物體外結合膽汁酸的能力為26.05%，與本研究對成品茶水提液的膽汁酸結合的數據結果（27.15%）相近。在多酚與多糖的含量方面，六堡毛茶的多酚含量為28.41%[17]，多糖含量為0.88%[18]；綠茶的多酚含量為27.52%～29.62%[19]，多糖含量1.62%～4.34%[20]，且絕大多數被測樣品的多糖含量在3%以下。本研究所測得的六堡成品茶中多酚含量為17.87%，多糖含量為3.32%。綜上，多酚含量：綠茶≈六堡毛茶＞六堡成品茶；多糖含量：六堡成品茶≥綠茶＞六堡毛茶。相似的，分析本研究中不同提取相的膽汁酸結合能力與多酚多糖的含量可以發現：膽汁酸結合能力：乙酸乙酯相＞茶葉水提液＞水余相＞醇沉相＞氯仿相；多酚含量：乙酸乙酯相＞氯仿相＞水余相＞茶葉水提液＞醇沉相；多糖含量：醇沉相＞水余相＞乙酸乙酯相＞氯仿相＞茶葉水提液。結合綠茶、六堡毛茶、六堡成品茶與六堡成品茶各相的膽汁酸結合能力與多酚多糖的含量不同，可以推測，多糖含量與膽汁酸結合能力的相關性不高；多酚含量與膽汁酸結合能力更相關，多酚含量越高往往也有更高的膽汁酸結合能力，但這不是絕對的，還與多酚的具體組成有關。因此，本研究將六堡茶中的特征物質作為活性成分研究的主要對象，并參考林小珊[13]針對六堡茶中的特征等物質的研究確定了具體物質。

通過對各相的主要特征物質的含量檢測結果可以發現，六堡茶乙酸乙酯相與水余相的多酚含量、種類豐富程度和膽汁酸結合率明顯高于其他相。可以說明豐富的多酚的確具有較強的膽汁酸結合能力，多名學者的研究也證明了這一點[21,22]。但是本次研究也發現，多酚含量較高的氯仿相膽汁酸結合能力卻最低，這與其含有的主要成分有關。氯仿相中含有的多酚類物質只有GA與GC，它們都屬于非酯型兒茶素類物質。而已有的研究表明，酯型兒茶素（EGCG、GCG、ECG）具有更強的膽汁酸結合能力[23,24]，本研究的最終相關性分析的結果也證明了酯型兒茶素（EGCG、GCG、ECG）具有較強的膽汁酸結合能力。此外，本次研究發現GA雖然屬于非酯型兒茶素類物質，但相關性分析表明與膽汁酸結合能力中具有顯著正相關性。Craig[25]認為綠茶中的GA可能通過減少膽固醇吸收而起到降血脂的作用。Kirana[26]研究中發現，GA也能有效降低膽固醇的膠束溶解度，表明GA部分也是決定膽固醇吸收活性的關鍵。因此，在膽汁酸結合能力的大小還應對非酯型兒茶素進行進一步研究。

Mao[27]采用高脂血癥大鼠的動物模型發現六堡茶多糖具有明顯的輔助降血脂作用，發現六堡茶多糖可以明顯降低高脂飲食大鼠的TC、TG和LDL-C，但對高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）無顯著影響；而且可以不通過改變動物的攝食量、糞便排泄量來影響大鼠體重水平。Qin[9]比較了發酵前后六堡毛茶和成品茶多糖與它們精制后的多糖組分的組成、結構、功能的差異性，結果發現經過發酵后，六堡毛茶多糖的抗凝血能力活性顯著優于成品茶多糖，但膽汁酸結合能力二者相當。本實驗也發現醇沉相多糖含量最高（47.07%），多酚含量最低（6.90%）且不含有測定的特征物質，但仍舊具有與水提液體相當的膽汁酸結合能力，說明多糖的確具有一定的輔助降血脂作用。

在本研究中，初步找出了在六堡茶中具有膽汁酸結合能力的主要物質，但是研究僅對六堡茶中的特征化學成分進行了測定；六堡茶中還有大量其他的特征成分，還需要進一步的探究。本研究得出的結論對于六堡茶產品保健功能的證明與六堡茶產業的健康積極發展具有一定的促進意義。

4　結論

以課題組利用指紋圖譜技術確定的六堡茶中的特征物質作為基礎，研究了不同溶劑部分膽汁酸結合能力。證明所采用的溶劑提取法能夠富集活性成分，并通過分析膽汁酸結合能力與特征物質及多糖、多酚的相關性關系，發現除酯型兒茶素外，GA、總酚含量也具有較好的膽汁酸結合能力，多糖也有一定的結合膽汁酸能力?？梢酝茢?，六堡茶中具有結合膽汁酸能力的主要為酚類成分，多糖等其它物質具有一定協同作用。

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Study on Chemical Constituents with Bile Acid Binding Ability in Liupao Tea

Liupao finished tea was used as raw material, the different polar parts were extracted by solvent extraction, the bile acid binding ability was tested, and the main chemical components were determined by high performance liquid chromatography. Finally, the main chemical components with bile acid binding ability were found by correlation analysis. Through the correlation analysis between bile acid binding ability and characteristic substances, polyphenols and polysaccharide content, it was found that phenols had the ability to bind bile acids in Liupao tea. In addition to ester catechins, the content of gallic acid(GA) and total phenols also has a strong correlation relationship with the binding ability of bile acids, and polysaccharides also had a certain ability to bind bile acids.

Liupao tea; bile acid binding capacity; lipid-lowering; phenolic compounds

TS27; TS201

A

1008-1151(2022)02-0040-05

2021-12-19

國家自然基金項目（32160571）。

陳歡（1997－），女，廣西大學在讀碩士研究生，從事六堡茶微生物安全與功能成分的研究。