基于網絡藥理學探討竹節(jié)參防治肝癌的作用機制

吳廣陽　唐 浪　詹 杰　趙 芬　黃 勝

基于網絡藥理學探討竹節(jié)參防治肝癌的作用機制

吳廣陽唐 浪詹 杰趙 芬黃 勝

（湖北民族大學，湖北 恩施 445000）

基于網絡藥理學探討竹節(jié)參防治肝癌的作用機制。利用TCMSP、Swiss Target Prediction數據庫結合文本挖掘方式，提取竹節(jié)參的化合物成分、化合物靶點關系，利用OMIM和Gene Cards網站提取竹節(jié)參的疾病靶點，R語言V4.0.3繪制Venny圖以獲得交集靶點，相關信息導入Cytoscape V3.8.2以獲得化合物-靶點-疾病網絡；依據交集靶點，在STRING網站獲得蛋白互作網絡，R語言V4.0.3進行GO、KEGG富集分析。在TCMSP、Swiss Target Prediction庫中共獲得15種有效化合物，包括皂苷、多糖、黃酮類等，對應靶點數259個，藥物與疾病交集靶點57個，導入STRING網站發(fā)現(xiàn)連線較多的靶蛋白為AKT1、VEGFA、CASP3等，藥物-有效化合物-靶點-疾病網絡圖表明，度值較高的化合物是竹節(jié)參皂苷Ⅳa、竹節(jié)參皂苷Ⅳa_qt、人參皂苷 Rg2_qt等；GO生物學過程富集分析發(fā)現(xiàn)：竹節(jié)參的關鍵靶蛋白主要通過調控內肽酶、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶、DNA結合轉錄激活活性RNA聚合酶II特異性等方式起到改善肝癌的作用；KEGG富集通路發(fā)現(xiàn)竹節(jié)參影響肝癌主要通過PI3K-AKT、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、脂質和動脈粥樣硬化等信號通路。竹節(jié)參防治肝癌具有多靶點、多通路的特點，其治療機制可能是通過調控AKT1、VEGFA、CASP3的活性有關。

竹節(jié)參；肝癌；網絡藥理學；靶點

引言

肝癌的發(fā)病率位居全球惡性腫瘤第六位，死亡率位居第四位，其中肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）占肝癌的75%～85%，每年全球新增肝癌病例約84萬，新增死亡病例約78萬[1]，據其臨床表現(xiàn)、體征，可將其歸屬于中醫(yī)的“肝積”“癖積”“脅痛”“黃痘”等病癥的類別。肝癌常見臨床表現(xiàn)為納呆、消瘦、脅痛、上腹腫塊、發(fā)熱、黃疸和腹水等，中醫(yī)藥治療在控制患者病情發(fā)展、減少復發(fā)、改善癥狀體征、提高生存質量、延長生存等方面有著自己獨特的優(yōu)勢[2]。

竹節(jié)參，又名白三七、野三七、竹節(jié)人參等，是五加科植物竹節(jié)參Panax japonicus C.A.Mey.的干燥根莖。其性溫，味甘、苦，具有補虛強壯、散瘀止血、止痛的功效。有研究證明，它對肝損傷、肝炎、肝癌等具有較好的預防與治療作用。然而竹節(jié)參影響肝癌確切機制尚不清楚，因此本文通過網絡藥理學探討竹節(jié)參影響肝癌的機制，以挖掘潛在的治療靶點，為竹節(jié)參改善肝癌提供一定的理論依據。

1　材料與方法

1.1　藥物-化合物-靶點-疾病網絡圖

從TCMSP、Swiss Target Prediction數據庫提取竹節(jié)參的化合物、化合物靶點關系，OMIM、Gene Cards網站檢索疾病“cancer of the liver”的靶點，獲得疾病的靶點關系；R語言V4.0.3軟件安裝“Venn Diagram”包，得到藥物-化合物-靶點-疾病信息，然后將相關信息導入cytoscape V3.8.2，以獲取藥物-化合物-靶點-疾病網絡圖。

1.2　PPI網絡

將交集靶點導入STRING網站，得到PPI網絡圖，將TSV文件導入R語言V4.0.3軟件，得到PPI統(tǒng)計圖。

1.3　GO、KEGG富集分析

在R語言V4. 0. 3 軟件中安裝“RSQLite”“org. Hs. eg. db”程序包，將竹節(jié)參的交集靶點名轉換為對應的基因ID；安裝“colorspace”“stringi”“DOSE”“clusterProfiler”“pathview”程序包，基于基因ID分別進行GO、KEGG富集分析得到圖表。

2　結果

2.1　化合物-靶點-疾病網絡

利用TCMSP、Swiss Target Prediction數據庫提取竹節(jié)參的化合物組成、化合物靶點關系（以Swiss Target Prediction生物利用度評分高，胃腸道吸收高為標準），得出竹節(jié)參含有15種有效化合物，包括皂苷、多糖、黃酮類等，對應靶點數259個，靶點排名較前的化合物為竹節(jié)皂苷Ⅳa、竹節(jié)皂苷Ⅳa_qt、人參皂苷Rg2_qt等。與肝癌取交集后，交集靶點57個（見圖1），然后交集靶點導入cytoscape V3.8.2以獲取藥物-化合物-靶點-疾病網絡圖，排名較前的蛋白為AKT1、VEGFA、CASP3等（見圖2）。

圖1　竹節(jié)參有效成分與肝癌的交集靶點

圖2　“藥物-活性成分-關鍵靶點-疾病”可視化網絡圖

2.2　PPI網絡

將交集靶點導入STRING網站，得到竹節(jié)參治療肝癌的靶蛋白相互作用網絡圖（見圖3），將TSV文件導入R語言V4.0.3軟件，得到PPI統(tǒng)計圖（見圖4）。PPI統(tǒng)計圖顯示，AKT絲氨酸/蘇氨酸激酶1（AKT serine/threonine kinase 1，AKT1）、血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、胱天蛋白酶3（caspase 3，CASP3）、JUN原癌基因（Jun proto-oncogene，AP-1 transcription factor subunit，JUN）、基質金屬肽酶 9（matrix metallopeptidase 9，MMP9）、信號轉導和轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、雷帕霉素激酶機械靶（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）、前列腺素-內過氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）、細胞周期蛋白D1（cyclin D1，CCND1）、雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator activated receptor gamma，PPARG）、成纖維細胞生長因子2（fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF2）、去乙酰化酶1（ sirtuin 1，SIRT1）、B細胞淋巴瘤2（BCL2 like 1，BCL2L1）、基質金屬肽酶2（matrix metallopeptidase 2，MMP2）、白細胞介素 2（interleukin 2，IL2）、絲裂原活化蛋白激酶 1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、胱天蛋白酶8（caspase 8，CASP8）、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亞基α（phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha，PIK3CA）可與多種蛋白發(fā)揮作用。

圖3　竹節(jié)參治療肝癌的靶蛋白相互作用網絡圖

圖4　竹節(jié)參治療肝癌的靶蛋白相互作用統(tǒng)計圖

2.3　GO、KEGG富集分析

通過GO富集分析交集靶點可觀察到，內肽酶活性（endopeptidase activity）、核受體活性（nuclear receptor activity）、配體激活的轉錄因子活性（ligand-activated transcription factor activity）、絲氨酸型肽酶活性（serine-type peptidase activity）、絲氨酸水解酶活性（serine hydrolase activity）、RNA聚合酶II特異性 DNA 結合轉錄因子的結合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性（protein serine/threonine kinase activity）、絲氨酸型內肽酶活性（serine-type endopeptidase activity）、細胞表面受體蛋白酪氨酸激酶活性（transmembrane receptor protein tyrosine kinase activity）、磷酸酶結合（phosphatase binding）、DNA結合轉錄因子結合（DNA-binding transcription factor binding）、蛋白酶結合（protease binding）、胰島素受體基底結合（insulin receptor substrate binding）、半胱氨酸型內肽酶活性參與凋亡信號通路（cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic signaling pathway）、蛋白酪氨酸激酶活性（protein tyrosine kinase activity）、細胞表面受體蛋白激酶活性（transmembrane receptor protein kinase activity）、肝素結合（heparin binding）、半胱氨酸型內肽酶與細胞凋亡的關系（cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic process）等生物進程可能為竹節(jié)參治療肝癌的機制（見圖5、表1）。

圖5　竹節(jié)參治療肝癌的GO富集分析柱狀圖

表1　竹節(jié)參治療肝癌的GO富集分析表

KEGG富集分析可觀察到糖尿病并發(fā)癥中的衰老信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）、脂質和動脈粥樣硬化（Lipid and atherosclerosis）、內分泌抵抗（Endocrine resistance）、癌癥中的蛋白多糖（Proteoglycans in cancer）、胰腺癌（Pancreatic cancer）、EGFR酪氨酸激酶抑制劑抗性（EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance）、化學致癌-受體激活（Chemical carcinogenesis-receptor activation）、PI3K-AKT信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、人巨細胞病毒感染（Human cytomegalovirus infection）、前列腺癌（Prostate cancer）、膀胱癌（Bladder cancer）、麻疹（Measles）、大腸癌（Colorectal cancer）、丙型肝炎（Hepatitis C）、人類乳突病毒感染（Human papillomavirus infection）、Foxo 信號通路（FoxO signaling pathway）、C 型凝集素受體信號通路（C-type lectin receptor signaling pathway）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）等信號通路可能為竹節(jié)參治療肝癌的機制（見圖6、表2）。

圖6　竹節(jié)參治療肝癌的KEGG富集分析柱狀圖

表2　竹節(jié)參治療肝癌的KEGG富集分析表

3　討論

肝癌是全球常見和致命的惡性腫瘤之一，目前，治療肝癌最有效的方法是手術切除，這種方法會導致許多手術并發(fā)癥和副作用，如肝缺血、腸道出血[3]。中醫(yī)認為，肝癌的發(fā)生、發(fā)展是內外因共同導致的結果，其中正虛為本、邪實為標、氣滯血瘀為其主要病機，竹節(jié)參具有補虛強壯、散瘀止血、止痛的功效，可以較好地改善病癥。

有研究可知竹節(jié)參中活性成分主要是竹節(jié)皂苷Ⅳa、竹節(jié)皂苷Ⅳa_qt、竹節(jié)皂苷Ia、竹節(jié)皂苷Ib、竹節(jié)皂苷III、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rg2_qt等，有研究證明，竹節(jié)參皂苷與多糖都都較好的抗腫瘤作用，竹節(jié)參皂苷還能抑制抑制耐藥相關蛋白，多藥耐藥基因從而增強抗癌藥物與癌癥細胞的結合，增強靶向治療的作用[4]。竹節(jié)皂苷Ⅳa、人參皂苷通過抑制腫瘤細胞增殖、凋亡、信號轉導、抑制腫瘤血管生成的方式來防治肝癌[5]。

通過構建竹節(jié)參與肝癌交集靶基因PPI網絡，獲得PPI網絡核心靶基因AKT1、VEGFA、CASP3等。PI3K/AKT通路被激活可能是多種癌癥發(fā)生的機制，其中通過藥物抑制PI3K/AKT通路上相關蛋白PI3K、AKT、AFP、PTEN等蛋白的表達，可以達到改善早期肝癌病變的作用[6]。血管生成被認為是惡性腫瘤發(fā)展的一個重要過程，并且與癌癥的進展和轉移有關。HCC是肝臟最常見的原發(fā)腫瘤，被認為是典型的血管生成腫瘤[7]。lncRNA-PDPK 2P與PDK 1相互作用并通過PDK 1/AKT/CASP3信號通路促進HCC進展。lncRNA-PDPK 2P可以促進肝癌進展，這表明它可能是臨床上有價值的生物標志物和作為用于診斷、預后，以及治療肝細胞癌的分子靶標[8]。

GO生物學過程富集分析主要集中在內肽酶活性、核受體活性、配體激活的轉錄因子活性、絲氨酸型肽酶活性、絲氨酸水解酶活性、RNA聚合酶II特異性DNA結合轉錄因子的結合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、絲氨酸型內肽酶活性、細胞表面受體蛋白酪氨酸激酶活性、磷酸酶結合、DNA結合轉錄因子結合、蛋白酶結合、胰島素受體基底結合、半胱氨酸型內肽酶活性參與凋亡信號通路、蛋白酪氨酸激酶活性、細胞表面受體蛋白激酶活性、肝素結合、半胱氨酸型內肽酶與細胞凋亡的關系等生物過程。其中中性內肽酶CD10可能是B系急性淋巴細胞白血病和多種癌癥的診斷和預后的非常有用的工具。已經檢測到中性內肽酶的表達在腫瘤細胞中可以上調或下調，中性內肽酶間接和直接參與調節(jié)介導細胞遷移、增殖和存活的信號通路[9]。

KEGG富集分析可觀察到糖尿病并發(fā)癥中的衰老信號通路、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、脂質和動脈粥樣硬化、內分泌抵抗、癌癥中的蛋白多糖、胰腺癌、EGFR酪氨酸激酶抑制劑抗性、化學致癌-受體激活、PI3K-AKT信號通路、人巨細胞病毒感染、前列腺癌、前列腺癌、膀胱癌、麻疹、大腸癌、丙型肝炎人類乳突病毒感染、Foxo 信號通路、C 型凝集素受體信號通路、腫瘤壞死因子信號通路可能為竹節(jié)參治療肝癌的機制。其中PI3K/AKT通路是幾種人類癌癥中最常見的過度激活的細胞內通路之一，該通路作用于不同的下游靶蛋白，促進腫瘤細胞的癌變、增殖、侵襲和轉移，在多種癌癥類型中發(fā)現(xiàn)了多層次的損傷，包括突變和遺傳改變、miRNA序列的異常調節(jié)和級聯(lián)因子的異常磷酸化[10]。有研究表明馬尼布通過PI3K/AKT信號、趨化因子信號、TGF-β等通路引發(fā)癌癥[11]。細胞死亡途徑、DNA 損傷和突變以及炎癥是肝癌發(fā)生的驅動因素，抑制這些途徑可以防止早期肝癌的發(fā)展，但這種治療策略可能對晚期肝癌無效，炎癥和腫瘤反應性基質在許多癌癥中發(fā)揮重要作用，因此，通過免疫檢查點抑制劑阻斷促腫瘤的炎癥信號和增強腫瘤免疫力可能是治療肝癌的有效策略[12]。NF-κB和STAT3可能在肝臟炎癥反應和體內平衡維持中發(fā)揮重要作用，并對肝癌的發(fā)展和進展做出關鍵貢獻，盡管在人類肝癌中負責NF-κB和STAT3激活的機制尚不完全清楚，但在病毒性肝炎和肝脂肪變性中都出現(xiàn)了NF-κB調節(jié)的STAT3激活細胞因子IL-6表達的作用[13]。這些研究說明預測的通路是改善肝癌的關鍵通路。

4　結束語

基于網絡藥理學分析得到的活性成分與靶基因存在相關性，兩者之間有許多代謝通路，有一個關鍵分子調控多個通路，也有多個分子同時調控一個通路，反映了中藥可以通過多成分、多通路、多靶點干預疾病的發(fā)生發(fā)展。通過上述研究，研究人員可以從不同層面去了解竹節(jié)參改善肝癌的機制，以新的眼光去發(fā)掘民族藥的價值。竹節(jié)參為特色的土家藥，土家醫(yī)多用它補虛、抗炎、抗腫瘤。有許多研究證明，竹節(jié)參有改善肝癌的作用，但是對于其抗肝癌的具體活性成分、作用的相關靶蛋白、通過的具體通路仍然缺乏認識，通過此研究預測出竹節(jié)參相關的活性成分、關鍵靶點、信號通路，希望為竹節(jié)參的理論與臨床研究提供一定的理論支持，為后來研究者提供一點思路。但是竹節(jié)參的活性成分、靶基因的相互作用、關鍵通路的獲得是通過網絡數據庫模擬獲得，仍需要后期進一步的動物實驗或細胞實驗驗證。

[1]Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J]. A Cancer Journal for Clinicians, 2018, 68(6): 394-424.

[2]張宇，陳華國，趙超，等. 中藥有效成分抗肝癌作用機制研究進展[J]. 中國中藥雜志，2020，45(14): 3395-3406.

[3]Liao X., Bu Y, Jia Q. Traditional Chinese medicine as supportive care for the management of liver cancer: past, present, and future[J]. Genes and Diseases, 2020，7(3): 370-379.

[4]周靜，付先蕓，蔡三金，等. 竹節(jié)參的化學成分、藥理作用及質量標志物(Q-Marker)預測分析[J]. 中草藥， 2021，52(9): 2819-2830.

[5]陳穎，周巖，曹銀萍. 中藥皂苷類化合物體外抗腫瘤研究進展[J]. 中國醫(yī)院藥學雜志，2011，31(7): 591-593.

[6]Jiang N, Dai Q, Su X, et al. Role of PI3K/AKT pathway in cancer: the framework of malignant behavior[J]. Molecular Biology Reports, 2020, 47(6): 4587-4629.

[7]Lin J, Cao S, Wang Y, et al. Long non-coding RNA UBE2CP3 enhances HCC cell secretion of VEGFA and promotes angiogenesis by activating ERK1/2/HIF-1alpha/ VEGFA signalling in hepatocellular carcinoma[J]. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research, 2018, 37(1): 113.

[8]Pan W, Li W, Zhao J, et al. lncRNA-PDPK2P promotes hepatocellular carcinoma progression through the PDK1/ AKT/Caspase 3 pathway[J]. Molecular Oncology, 2019, 13(10): 2246-2258.

[9]Mizerska-Dudka M, Kandefer-Szerszen M. Opioids, neutral endopeptidase, its inhibitors and cancer: is there a relationship among them?[J]. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis, 2015, 63(3):197-205.

[10] Rascio F, Spadaccino F, Rocchetti, M T, et al. The pathogenic role of PI3K/AKT pathway in cancer onset and Drug resistance: an updated review[J]. Cancers, 2021, 13(16): 3949.

[11] Goodson W H, Lowe L, Carpenter D O, et al. Assessing the carcinogenic potential of low-doseexposures to chemical mixtures in the environment: the challenge ahead[J]. Carcinogenesis, 2015, 36(Suppl 1): S254-S296.

[12] Yang Y M, Kim S Y, Seki E. Inflammation and liver cancer: molecular mechanisms and therapeutic targets[J]. Seminars in Liver Disease, 2019, 39(1): 26-42.

[13] He G, Karin M. NF-κB and STAT3-key players in liver inflammation and cancer[J]. Cell Research, 2011, 21(1): 159-168.

Study on the Mechanism of Prevention and Treatment of Liver Cancer by Panax Japonicus Based on Network Pharmacology

To explore the mechanism of prevention and treatment of liver cancer of Panax japonicus based on network pharmacology.TCMSP, Swiss target prediction database combined with text mining were used to extract the compound components and compound target relationship of Panax japonicus, and OMIM and Gene Cards websites were used to extract the disease targets of Panax japonicus, R language V4.0.3 draw Venny diagram to obtain intersection targets, and import relevant information into Cytoscape V3.8.2 to obtain a compound target disease network, according to the intersection target, the protein interaction network was obtained at the string website, GO and KEGG enrichment analysis was performed in R language V4.0.3.A total of 15 effective compounds, including saponins, polysaccharides and flavonoids, were obtained in tcmsp and Swiss target prediction libraries, with 259 corresponding target points and 57 drug disease intersection targets. It was found that the target proteins with more connections were AKT1, VEGFA and CASP3. The drug-effective compound-target-disease network diagram showed that the compounds with high degree value are Panax japonicus saponin Ⅳa and Panax japonicus saponin Ⅳa_qt, ginsenoside Rg2_qt, etc; GO biological process enrichment analysis found that the key target proteins of Panax japonicus can improve liver cancer mainly by regulating endopeptidase, protein serine/threonine kinase, DNA binding transcriptional activation activity and RNA polymerase II specificity; KEGG enrichment pathway found that bamboo ginseng affected liver cancer mainly through PI3K-AKT, Kaposi sarcoma associated herpesvirus infection, lipid and atherosclerosis.The prevention and treatment of liver cancer by Panax japonicus has the characteristics of multi-target and multi-channel. Its therapeutic mechanism may be related to regulating the activities of AKT1, VEGFA and CASP3.

Panax japonicus; liver cancer; network pharmacology; target

R285

A

1008-1151(2022)02-0114-05

2021-11-04

吳廣陽（1994－），男，湖北民族大學醫(yī)學部在讀碩士研究生，研究方向為民族醫(yī)學。

黃勝（1987－），男，湖北民族大學研究生導師，研究方向為微生物來源天然產物的合成。