香梨優斑螟EPSXL基因生物信息學及表達分析

賀鵬鵬 張來斌 肖海兵 劉振亞 楊明祿 韓旭

摘? ? 要：決定香梨優斑螟性別的基因尚不清楚，推測香梨優斑螟Sex-lethal（EPSXL）基因是潛在的主要性別決定基因，擬研究其在雌、雄個體不同組織及發育時期的表達。利用生物信息學軟件預測香梨優斑螟EPSXL基因的氨基酸序列、分析蛋白質特性和構建近緣物種進化樹，并采用熒光定量PCR技術檢測該基因在頭、胸、腹、翅中的表達情況。發現EPSXL基因編碼區長度為1 005 bp，編碼334個氨基酸，具有2個保守的RRM結構域。其蛋白為堿性親水性蛋白質，二級結構以α螺旋和無規則卷曲為主，有51個磷酸化位點和2個N-糖基化位點，不存在跨膜結構及信號肽。對比發現，EPSXL氨基酸序列與臍橙螟ATSXL的序列相似性最高。在雄性香梨優斑螟中EPSXL在成蟲期和蛹期中mRNA表達量較高，在雌性中則在1齡和3齡幼蟲期中表達量較高，在雄性腹部和胸部中的表達量極顯著高于雌性相應組織。EPSXL蛋白具有2個保守的功能結構域，該基因mRNA表達在不同性別與組織間差異明顯，能夠為深入研究其功能提供理論依據。

關鍵詞：香梨優斑螟;EPSXL基因;生物信息學;基因表達

中圖分類號：S436.612.2+9? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2022.04.001

Bioinformatics and Expression Analysis of EPSXL Gene of Euzophera pyriella

HE Pengpeng1， ZHANG Laibin1， XIAO Haibing1，2， LIU Zhenya1，2， YANG Minglu1，2， HAN Xu1，2

（1.College of Agriculture， Tarim University， Alar， Xinjiang 843300， China; 2.Southern Xinjiang Key Laboratory of IPM of Tarim University，Alar， Xinjiang 843300， China）

Abstract：The gene that determines the sex of Euzophera pyriella is still unclear. It is speculated that the Sex-lethal（EPSXL） gene of E. pyriella is a potential major sex-determining gene. This research aims to study its expression in different tissues and developmental stages of female and male individuals. Bioinformatics software was used to predict the amino acid sequence of EPSXL gene， to analyze the protein characteristics and construct the phylogenetic tree of its genetically close species. Quantitative PCR was applied to detect the expression of EPSXL gene in the head， thorax， abdomen and wing. It was found that the EPSXL gene coding region was 1 005 bp in length， encoded 334 amino acids， and had 2 conserved RNA recognition motif （RRM） domains. The protein was a basic hydrophilic protein. The secondary structure was mainly constituted by alpha helix and random coils. There were 51 phosphorylated sites and 2 N-glycosylation sites， but no transmembrane structure and signal peptide. By comparison， it was found that the amino acid sequence of EPSXL had the highest similarity with the sequence of Amyelois transitella. The mRNA expression of EPSXL was higher in the adult and pupal of the male， while it was higher in the 1st and 3rd instar larvae of the female. The mRNA expressions of EPSXL in the abdomen and thorax of males were significantly higher than those in the female tissues. EPSXL protein has two conserved functional domains， and its mRNA expression differed obviously between gender and tissue， which can provide a theoretical basis for in-depth study of its function.

Key words： Euzophera pyriella;EPSXL gene;bioinformatics;gene expression

香梨優斑螟（Euzophera pyriella Yang）屬鱗翅目螟蛾科斑螟亞科優斑螟屬，主要危害梨、蘋果、杏、桃和棗等果樹。其中，危害最重的是庫爾勒香梨，部分產區被害率高達90%，危害嚴重時可造成樹體衰弱死亡[1]。隨著動物基因組測序技術的快速發展，目前有關昆蟲雌雄性別發育相關基因的研究已有一定進展，性別決定的開關Sex-lethal（SXL）基因已經在多個物種中被鑒定出來，包括黑腹果蠅、家蠶、羅氏沼蝦、東亞飛蝗、克氏原螯蝦和煙粉虱等[2-7]。在黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）性別決定機制中關于SXL基因研究較為深入，SXL基因的作用是通過激活其活化蛋白來控制生物體細胞的性別分化、生殖細胞的分化以及劑量補償[4]。在果蠅體內X∶A的信號調控SXL基因表達，當比值為1時，SXL活性蛋白被激活，用來調控下游性別分化相關基因的表達，使果蠅個體發育成雌性;反之果蠅個體發育成雄性[8]。果蠅屬以外，如地中海實蠅等昆蟲母體transformer（TRA）基因替代SXL的作用，TRA基因通過自我調控而形成雌特異性的剪接，進而調控下游的doublesex（DSX）基因[9]。家蠶中，SXL基因在雌雄之間差異表達，可能與其性別決定有關，但家蠶基因組中沒有TRA基因[10]，可能與PSI和HRP28基因的調節有關[11]。由此可見，調控途徑上游的基因在不同昆蟲中有較大的變異，而底端的DSX基因較為保守[12]。

SXL是一個RNA結合蛋白，含有兩個RNA識別結構域（RNA recognition motifs，RRM）[3]，該蛋白除了結合自身發生正向自我調控功能以外，還調控除家蠶外的其他昆蟲TRA和male-specific lethal-2（MSL-2）[10]。SXL蛋白通過結合SXL RNA轉錄本，選擇具有雌性特異性的RNA剪接，使SXL蛋白具有功能性;其次是通過結合TRA RNA轉錄本，選擇具有選擇性剪接的TRA轉錄本，使TRA調控蛋白具有活性與transformer 2（TRA-2）共同作用于DSX的轉錄本，經一系列調控及編碼過程使個體向著雌性方向分化發育[13]。

隨著分子生物學及計算機的發展，大數據和生物信息學工具在生命科學研究中發揮越來越重要的作用，軟件能夠較為準確的預測基因功能。本研究利用生物信息學方法，對EPSXL基因進行生物學特性分析，利用熒光定量qPCR技術研究不同發育時期及組織的表達特征，為后期該基因功能研究奠定基礎。1 材料和方法

1.1 試蟲

EPSXL基因序列來自課題組香梨優斑螟轉錄組測序數據，香梨優斑螟試蟲來自實驗室飼養種群。

1.2 生物信息學分析

使用在線生物軟件ORF finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）預測EPSXL基因的開放閱讀框及編碼區序列組成，利用ExPASy數據庫的ProtParam（http：//www.exPasy.org/tools/protparam）軟件對EPSXL蛋白的理化特性進行分析。用DNAMAN軟件對各物種的SXL氨基酸序列進行比較分析。利用SMARTS在線軟件（https：//smartsm.embl-heidelberg.de/）預測結構域。選用MEGAX軟件中的鄰接法（Neighbor-Joining）對EPSXL及NCBI數據庫中相似度較高的氨基酸序列構建系統進化樹，其中自展值（Bootstrap-value）設為1 000次，檢驗各節點的置信度。

1.3 總RNA的提取和cDNA的合成

每個處理分別收集香梨優斑螟卵40枚、1齡幼蟲10頭、3齡幼蟲雌雄各3頭、5齡幼蟲雌雄各3頭、雌雄蛹各5頭、雌雄成蟲各5頭，以及雌雄成蟲20只解剖后得到頭、胸、腹、翅組織樣品。每一個處理3個生物學重復，采集后的樣品經液氮罐速凍后于-80 ℃冰箱保存備用。采用Trizol法提取各個試驗樣品的總RNA。利用核酸檢測儀檢測含量與質量，檢測合格后保存于-80 ℃冰箱備用;根據反轉錄試劑盒（MightyScript第一鏈cDNA合成Master Mix）說明進行反轉錄，獲得cDNA樣品-20 ℃保存備用。

1.4 熒光定量PCR及分析

在該基因保守區利用Primer Premier5.0軟件設計熒光定量PCR引物（表1），選取TUB為內參基因，使用SGExcel Ultra SYBR Mixture試劑盒和熒光定量PCR儀（Eppendorf Mastercycler ep realplex）進行相對定量分析。反應程序：95 ℃預變性2 min;95 ℃變性5 s;60 ℃退火20 s;40個循環，并設置溶解曲線溫度變化95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。使用2-△△Ct法分析香梨優斑螟SXL基因在不同發育時期及組織的相對表達情況，以軟件GraphPad Prism 8對數據統計分析，使用單因素方差分析方法進行顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 EPSXL基因的序列分析

EPSXL基因序列的編碼區為1 005 bp，共編碼334個氨基酸。EPSXL蛋白相對分子質量為37 170.76，分子式為C1641H2495N481O481S16，理論等電點為9.23，脂肪系數為52.63，平均親水系數為-0.705（親水），不穩定系數為39.18，EPSXL蛋白在體外可能較穩定。該蛋白序列不存在信號肽和跨膜區。二級結構主要是無規則卷曲和α螺旋為主，有2個N-糖基化位點和51個磷酸化位點，其中第109和185處為N-糖基化位點，蘇氨酸磷酸化位點15個，絲氨酸磷酸化位點18個，酪氨酸磷酸化位點17個。

2.2 EPSXL氨基酸序列分析

通過NCBI檢索獲得其他昆蟲SXL蛋白的氨基酸序列，使用DANMAN軟件將所得氨基酸序列與其他昆蟲的SXL氨基酸序列進行多重比較分析，香梨優斑螟（Euzophera pyriella）與臍橙螟蛾（Amyelois transitella）、地中海粉螟（Ephestia kuehniella）、粉紋夜蛾（Trichoplusia? ?ni）、草地貪夜蛾（Spodoptera? frugiperda）和斜紋夜蛾（Spodoptera litura）的SXL氨基酸序列相似性高達91.99%（圖1）。通過SMARTS在線軟件分析發現，該基因存在兩個RRM結構域，屬于SXL家族（圖2）。

為了解香梨優斑螟SXL基因與其他昆蟲的進化關系，使用MEGA-X軟件將香梨優斑螟（Euzophera pyriella）與臍橙螟蛾（Amyelois transitella）、地中海粉螟（Ephestia kuehniella）、蠟螟（Galleria mellonella）、煙草天蛾（Manduca sexta）、粉紋夜蛾（Trichoplusia ni）、草地貪夜蛾（Spodoptera? frugiperda）、斜紋夜蛾（Spodoptera litura）、偏瞳蔽眼蝶（Bicyclus anynana）、小菜蛾（Plutella xylostella）、家蠶（Bombyx mori）、菊黃花粉蝶（Zerene cesonia）的SXL基因氨基酸序列采用鄰接法構建系統進化樹，bootstrap-value設置為1 000次。EPSXL蛋白與臍橙螟聚為一支（圖3），兩者親緣關系最近，其次是地中海粉螟。

2.3 EPSXL在不同發育時期的表達分析

EPSXL在不同發育時期中都有表達，但存在著較大的差異，3齡以后雌雄之間差異明顯（圖4），雄成蟲期的表達量達到高峰，其次是蛹期、1齡幼蟲期和3齡幼蟲期，其他時期EPSXL表達量相對較低;雌蟲則是1齡幼蟲期的表達量最高，其次是3齡幼蟲期，其他蟲態表達量相對較低。

2.4 EPSXL在成年雌雄不同組織中的表達分析

EPSXL成蟲雌雄性組織中均有所表達，但不同的組織中存在著較大的差異（圖5），EPSXL成蟲腹部表達量最高，其次是胸部和翅，頭部組織最低;EPSXL在頭部中的表達水平不存在雌雄差異;在雌性翅的EPSXL表達量極顯著高于雄性;而腹部和胸部組織中雄性表達水平極顯著高于雌性。

3 討論與結論

SXL家族蛋白在不同生物體中具有較高的同源性，均具有2個保守的RRM結構域[3]。該結構域可能調控下游靶基因。包括TRA基因、TRA-2基因、DSX基因[5]、MSL-2基因等，這些基因與性別決定都有一定的關系[14-15]。本研究預測的氨基酸序列也具有2個保守的RRM結構域，EPSXL蛋白屬于SXL家族具有高度保守性。

SXL基因在東亞飛蝗[5]、家蠶[10]和黑腹果蠅[15]各個發育時期和不同組織中均有表達，SXL活化蛋白將TRA、TRA-2等基因活化，活化后的基因統一作用于決定雌性性別的最后一個基因DSX[16]，并且還會導致生物體細胞的性別分化、生殖細胞的分化以及劑量補償發生變化[4]。本研究得出SXL基因在香梨優斑螟的不同發育時期及組織中均有表達，但表達水平有較大的差異：雌雄成蟲之間差異特別明顯，推測表達情況與香梨優斑螟性器官發育過程有關;腹部中的表達水平最高，而在其他組織中的表達水平顯著低于腹部，可能腹部存在精巢和卵巢，黑腹果蠅和家蠶在卵巢中表達明顯高于其他組織[17-18]。雖然EPSXL基因大量存在于腹部中，但是該基因是否與香梨優斑螟性功能有關，還有待進一步研究。

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