荷包牡丹的組培快繁技術研究

摘? ? 要：為解決荷包牡丹（Lamprocapnos spectabilis 'Amore Rose'）的快繁問題，以荷包牡丹試管苗的葉片為外植體材料，進行了組培快繁技術的試驗研究，建立了快繁技術體系。結果表明，以幼嫩新葉為外植體材料，更有利于愈傷組織及叢生芽的形成;初代培養基以MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 KT+0.1 mg·L-1 NAA為最優，叢生芽的誘導率為85.7%;繼代增殖培養基以MS+0.5 mg·L-1 6-BA +0.05 mg·L-1 NAA為最優，增殖系數達3.5;生根培養基以1/2 MS+0.5 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 IBA為最優，生根率達到98%;在草炭∶珍珠巖∶蛭石=7∶3∶2的優質移栽基質上，煉苗成活率達95%以上。最適宜的培養溫度為20±1 ℃。用荷包牡丹的幼嫩試管苗葉片，通過愈傷組織誘導獲得再生植株，成功建立了組培快繁技術體系。

關鍵詞：荷包牡丹;幼嫩新葉;叢生芽;組織培養;玻璃化

中圖分類號：Q943.1? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2022.04.003

Study on Tissue Rapid Propagation of Lamprocapnos spectabilis 'Amore Rose'

WEI Jinli

（Beijing Florascape Co.， Ltd.， Beijing 100093， China）

Abstract： In order to solve the problem of rapid propagation of Lamprocapnos? spectabilis 'Amore Rose'， the leaves was used as the explants to conduct the research of tissue culture techniques of propagation， and establish the sterile rapid propagation system in vitro. The results showed that it was easier to form callus and buds with young new leaves as explants. MS + 0.5 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 KT+0.1 mg·L-1 NAA was the suitable medium for explants induction of callus and cluster buds， the induction rate of cluster buds was 85.7%; MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.05 mg·L-1 NAA was the optimizing medium for multipropagation， the multiplication coefficient could reach up to 3.5; 1/2 MS+0.5 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 IBA was the best medium for rooting， the rooting rate could reach to 98%. After 30 days transplanted into greenhouse， the survival rate of young plants were over 95%.The optimum culture temperature was 20±1 ℃. Regenerated plants were obtained from the leaves of young test tube plantlets of Lamprocapnos spectabilis? 'Amore Rose' through callus induction， and the technical system of tissue culture and rapid propagation was successfully established.

Key words： Lamprocapnos spectabilis'Amore Rose'; young new leaves; cluster buds; tissue culture; glass transition

荷包牡丹（Lamprocapnos spectabilis （L.） Fukuhara）又稱鈴兒草、鈴心草、瓔珞牡丹、荷包花、蒲包花、土當歸、活血草、錦囊花等，是罌粟科荷包牡丹屬多年生宿根草本花卉，原產中國河北和東北地區，日本和西伯利亞[1]。荷包牡丹耐寒、耐半陰，花期較早，在4—6月份，且花期較長，在綠化中可增添早春園林的色彩，尤其適合我國北方寒冷地區的栽植與應用[2]。其株高30～60 cm，葉叢美麗，總狀花序，花色有玫紅、粉紅和白色等，花朵玲瓏，形似荷包，色彩絢麗，是盆栽和切花的好材料，也適宜于布置花境和在樹叢、草地邊緣濕潤處叢植，亦可供庭園栽培觀賞，是景觀效果極好的宿根花卉[3]，在園林綠化應用中極其廣泛;同時，其全草可入藥，具有很好的藥用價值，其內含物荷包牡丹堿具有鎮靜和鎮痛作用，被廣泛應用醫學研究領域，尤其近年來應用于癌癥的治療研究，荷包牡丹堿對肝癌、胃癌和肺癌細胞的轉移、侵襲、增殖和生長具有抑制作用[4-6]，開發前景非常廣闊。目前，國內荷包牡丹的繁殖是通過分株法、扦插法和播種法來繁殖，扦插繁殖6—7月進行，成活率較低[7];分株繁殖3月初與10月進行，每2～3年方可進行一次分株[8]，受到季節和環境的影響限制，使得繁殖難度大效率低;播種繁殖，10月進行播種，翌年春季發芽，移栽后2～3年才能開花[9]，效率也很低。因此，通過組織培養技術能有效地解決荷包牡丹的快速繁殖問題。

目前，有關荷包牡丹的組培繁殖技術，在國內尚未見有公開報道的相關資料。本研究中的材料是從國外新引進的優良品種，數量只有幾十株，若用常規的方法來繁殖，除了繁殖效率低之外，可供取材的母本基數也甚少，很難在較短時間內大量繁殖走向市場。為滿足廣大愛好者和消費者的需求，荷包牡丹的組織培養技術研究，建立無性離體快繁體系和實現工廠化生產育苗是亟待解決的問題。本研究的結果，也可為其他的組培育苗或育種提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以荷包牡丹（Lamprocapnos spectabilis 'Amore Rose'）的試管苗葉片為材料，來源于從美國Terra Nova公司新引進的試管苗。

1.2 試驗方法

1.2.1 葉片誘導叢生芽 用來進行葉片誘導的培養基是在MS培養基的基礎上，添加不同濃度水平的6-BA、KT和NAA，以及白砂糖30 g·L-1和瓊脂粉4.5 g·L-1，培養基的pH值為5.8～6.2，滅菌溫度121? ℃，時間20 min。準備好培養基以后，將供試材料在超凈工作臺上的無菌條件下，切取帶有0.5～1 cm左右長葉柄的葉片為外植體材料，根據葉片大小可切分成2～3小片，將切分好的葉片平鋪接種于培養基上，試驗培養基共設5個處理，每個處理接種5瓶重復，每瓶接種7個外植體材料，接種完成后放入培養室進行培養（無特殊說明，培養條件均為以進口的飛利浦LED燈為光源，光強度為30 μmol·m-2·s-1，光照時長為每天10 h，培養溫度為20 ± 2 ℃），培養30 d時觀察、轉接并記錄結果。

1.2.2 叢生芽的繼代增殖培養 叢生芽繼代增殖的培養基是在MS培養基的基礎上，添加不同濃度水平的6-BA和NAA，其它同上。將葉片誘導所得愈傷組織以及不定芽，以1～2個芽為一叢進行分割后，接種到叢生芽繼代增殖培養基上，試驗培養基共設6個處理，每個處理接種5瓶重復，每瓶接種5個試驗材料，培養30 d時觀察、轉接并記錄結果。

1.2.3 增殖苗在不同溫度下進行培養 以增殖苗為試驗材料，接種到增殖培養基上，放入光照培養箱中進行培養，培養溫度設置為18 ℃±1 ℃，20 ℃±1 ℃，22 ℃±1 ℃高、中、低3種不同的溫度處理，每個處理5瓶重復，每瓶接種10個試驗材料，培養30 d時，觀察、轉接并記錄結果。

1.2.4 誘導生根培養 生根培養的培養基是以1/2 MS培養基為基礎，添加不同濃度水平的IBA和NAA，以及白砂糖20 g·L-1，其它同上。將繼代擴繁所得的叢生芽苗切成單株，選取植株標準達到株高3 cm和葉片數量4片及以上的無根單株壯苗，接種到生根培養基上，培養基共設7個處理，每個處理接種5瓶重復，每瓶接種10株苗，生根培養25 d時觀察統計結果。

1.2.5 生根苗的移栽煉苗 將生根后的瓶苗移到溫室，擰松瓶蓋放在苗床上，并用遮陽網進行遮光，以避免陽光直射造成培養瓶內溫度過高和光過強而使苗損傷，在瓶內煉苗2～3 d后將苗從培養瓶中取出，清洗干凈根部的培養基[10]，栽到裝有煉苗專用基質塊（按體積比優質草炭∶珍珠巖∶蛭石=7∶3∶2）的128孔穴盤上，栽完苗后立即噴一次水，噴施一次多菌靈1 000倍或甲霜猛辛1 000倍液，隨后放到煉苗床上進行養護，養護30 d時，統計成活率。

1.3 數據處理及分析

愈傷組織誘導率（%）=出愈傷組織的外植體數/接種的外植體數×100;芽誘導率（%）=分化出芽的愈傷組織外植體數/接種的外植體數×100;增殖倍數=接種后苗的總數量/接種前的總數量;可生根率（%）=可用來接生根苗的數量/苗的總數量×100;生根率（%）=有根的苗數量/最初接種的進行生根培養的苗數量×100。

采用Excel 2010和SPSS18.0軟件進行數據整理、統計和分析顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 葉片誘導叢生芽

將切分好的外植體葉片接種到不同的芽誘導培養基上（圖1- A），培養10 d時開始形成愈傷組織，20 d后開始形成叢生芽，30 d時已形成較多的叢生芽，并且有1～2 cm的完整小植株長起來。在外植體誘導叢生芽的過程中，植物生長物質的種類及濃度對叢生芽的誘導形成都有著不同程度的影響。在不添加任何植物生長物質的情況下，外植體葉片不會形成愈傷組織;在添加有細胞分裂素6-BA的培養基中，只有少數外植體誘導形成了較少的叢生芽，多數外植體只形成了較小的胚狀愈傷組織塊，沒有芽的形成，并且在添加較低濃度6-BA的培養基里連愈傷組織都沒有形成;而在添加了6-BA和KT兩種細胞分裂素的培養基中，有較多的胚狀愈傷組織和叢生芽形成（圖1-B），當KT的濃度增高時，有利于愈傷組織的形成，同時隨著6-BA和KT濃度的增高出現了玻璃化現象。在5個不同處理中，以同時添加0.5 mg·L-1 6-BA和KT兩種細胞分裂素的處理3培養基中的培養效果性狀表現為最佳，叢生芽的誘導率為85.7%，具體見表1。

2.2 叢生芽的繼代增殖培養

在外植體誘導叢生芽所得結果的基礎上，將由外植體培養獲得的不定芽，以1～2個芽為一叢切分后接種到繼代增殖培養基上，培養30 d時形成叢生芽。在繼代增殖培養過程中，不同的植物生長物質濃度不同對芽增殖的影響也有所不同。6-BA濃度增高時有利于芽的形成和增多，NAA濃度增高時有利于苗長高大。6-BA與NAA的配比比例和濃度越低時，苗相對較為高而粗壯，有利于生根培養;比例越高，有利于芽的形成，但隨著培養基中6-BA和NAA的濃度增大，玻璃化現象越嚴重，使有效增值倍數變低。在增殖培養基中，6-BA和NAA的添加濃度分別為0.5，0.05 mg·L-1時，也就是在處理3中增殖倍數最高，達到3.5，并且苗的生長情況相較也最佳;處理1中的苗更有利于生根培養，具體見表2。

2.3 增殖苗在不同溫度下進行培養

在18±1 ℃這樣較低的溫度下培養時，荷包牡丹的增殖苗生長相對較為緩慢，植株變得較為矮小，高度僅為2 cm，能夠用來進行接種生根培養的苗很少，在這樣的溫度環境下培養時，苗的生長周期變長，使得大量的生產出苗很難實現;當溫度升高到20±1 ℃這樣的中等溫度時，苗生長變得較快，芽苗增多的同時苗的質量也變得較好，苗株高能達到3 cm以上，可用來接種生根培養的大好苗數量增多，培養效果相較為最佳;當培養溫度升高到22±1 ℃時，在前期階段苗生長較快并且苗長得更高大一些，苗株高能達到4 cm以上，但到了后期開始出現玻璃化現象，尤其是基部的小芽隨著培養時間的增長玻璃化更為嚴重，使得整體芽苗的品質變差，能用來接種生根培養的大好苗數量明顯下降，具體見表3。

2.4 誘導生根培養

將繼代擴繁所得的切去基部小芽和愈傷組織的單株大苗接種到生根培養基上（圖1-C），培養15 d時開始有根形成;到20 d時多數苗有根形成;再到25 d時根系長達2 cm以上（圖1-D），生根率達到98%。試驗結果表明，植物生長物質的種類和濃度對根的形成有著較大影響，在荷包牡丹的生根培養過程中發現，將NAA和IBA結合起來使用時，生根效果明顯好于其中一種單獨使用的效果，在適宜的濃度中生根率和根的整齊度都明顯變好。不論是結合起來使用，還是單獨使用，在添加的植物生長物質的濃度過高時，對根的形成和生長都出現抑制現象。在7個不同的處理中，以處理5的培養效果為最佳。具體見表4。

2.5 生根苗的移栽煉苗

荷包牡丹的生根苗從培養瓶移出栽入煉苗基質后，將基質及苗全部用50%多菌靈1 000倍液噴施浸透，然后放在溫室溫度20～25 ℃和空氣濕度70%～85%的環境條件下養護，養護期間每隔7～10 d噴施一次濃度稀釋1 000倍的速溶復合肥（氮磷鉀含量比例為20∶20∶20），養護到15 d時已長出2片新葉（圖1-E），養護到30 d時根能夠長滿穴包住基質，長出4片左右新葉，株高為6 cm左右，苗健壯，成活率達到95%以上。

3 結論與討論

在以荷包牡丹的無菌葉片為外植體接種培養獲得叢生芽的過程中發現，植物生長調節劑是影響外植體材料形態發生的最關鍵因素，植物愈傷組織誘導及不定芽分化較大程度取決于植物生長調節劑的種類和濃度[11]，不同的植物生長調節劑種類和濃度，對外植體誘導形成愈傷組織及叢生芽有著不同程度的影響。在同等植物生長調節劑濃度水平下，越幼嫩的葉片組織啟動形成愈傷組織越早，并且愈傷組織易形成叢生芽，但隨著植物生長調節劑的濃度水平越高時易玻化[12-14];越老的葉片啟動越慢甚至有的不啟動，也不易形成芽。另外，當激素濃度越高時，越有利于愈傷組織的形成，尤其是KT對愈傷組織形成的促進作用明顯大于6-BA，但當其濃度過高時，愈傷變得松散而不利于芽的形成;適當降低細胞分裂素與生長素的比值也會對愈傷組織的增殖起到一定的促進作用[15-16]。

荷包牡丹對溫度比較敏感，當溫度較低光照較強時，玻璃化現象減少或無玻化，而當溫度低于18 ℃時，苗生長相對緩慢而植株矮小，甚至出現生長受阻現象;當溫度高于22 ℃以上時，會有玻璃化現象出現，隨著溫度的升高玻璃化苗的數量明顯增多，葉色為深綠色，呈水浸狀，即使剩余的沒有玻璃化的好苗質量有所降低，再次轉接或者接種生根苗的效果也不如中溫下培養的好。因此，在荷包牡丹的組織培養快繁過程中，溫度的控制很重要。

在生根培養過程中發現，在6-BA含量較低的培養基中，培養的苗增殖系數低，但苗壯而植株單一，這樣的苗更容易生根。在工廠化大量生產時，根據需求調控6-BA和NAA濃度比例，在生根培養前進行一次壯苗培養，這樣有利于提高苗的質量和降低生產成本[17]。經測算，結合溫度控制和壯苗培養，可使生產成本相較低溫下大幅下降30%以上。

另外，在荷包牡丹的培養過程中還發現，在苗生長過程中會分泌代謝產物使培養基慢慢褐變，由淺黃色到黃褐色逐漸變化，并隨時間越長顏色越深，溫度越高褐化現象也越明顯。這種培養基的褐變現象對苗生長影響不明顯，因此沒有進行深入研究。

參考文獻：

[1] 馬利娜， 馬健. 觀賞花卉珍品——荷包牡丹[J]. 中國園藝文摘， 2017， 33（7）： 168-169.

[2] 潘偉， 張爽. 荷包牡丹的繁殖與栽培管理技術[J]. 中國園藝文摘， 2010， 26（3）： 97-98.

[3] 姚如偉. 淺談荷包牡丹的栽培技術與應用[J]. 現代農業， 2021（3）： 64-65.

[4] 郭錳， 張成輝， 吳婷婷. 荷包牡丹堿對人肝癌MHCC97-H細胞轉移、侵襲的影響及機制研究[J]. 中草藥， 2019， 50（22）： 5515-5520.

[5] 汪詩卉， 陳劍群， 董秋菊， 等. 荷包牡丹堿對人胃癌 SGC-7901細胞生長的作用及機制初探[J]. 中華臨床醫師雜志（電子版）， 2013， 7（11）： 4898-4901.

[6] 劉巖， 張虹， 金雪， 等. 荷包牡丹堿對人肺癌A549細胞生長及端粒酶活性的抑制作用[J]. 中國藥理學與毒理學雜志， 2011， 25（6）： 543-546.

[7] 馬冬梅. 荷包牡丹栽培繁殖技術[J]. 種子世界， 2010（1）： 35-36.

[8] 沈慧. 荷包牡丹扦插繁殖[N]. 中國花卉報， 2005-06-11.

[9] 兌寶峰. 荷包牡丹栽培管理[N]. 中國花卉報， 2014-07-08（008）.

[10] 馬艷， 王靜飛， 劉婷， 等. 胡楊雜種葉片組培技術研究[J]. 中國野生植物資源， 2019， 38（4）： 1-6， 12.

[11] 馬崇堅， 鄭聲云， 卓海標. 粉葛種苗離體繁殖技術初步研究[J]. 廣東農業科學， 2013， 40（15）： 28-30， 35， 4.

[12] 白艷榮， 蔣亞蓮， 王進英. 花毛茛組培快繁技術研究[J]. 北方園藝， 2021（1）： 48-53.

[13] 陸從巍， 趙震虎， 王鵬， 等. 提高花卉組培苗移栽成活率的技術[J]. 農業科技通訊， 2005（4）： 22-23.

[14] 梁立東， 李明文. 俄羅斯楊樹新品種N12玻璃化組培苗恢復培養的研究[J]. 林業科技， 2020， 45（4）： 1-3.

[15] 蔡祖國， 徐小彪， 周會萍. 植物組織培養中的玻璃化現象及其預防[J]. 生物技術通訊， 2005， 16（3）： 353-355.

[16] 劉賓照， 高紅梅， 陶艷. 不同濃度3種激素對花毛茛組培增殖率的影響[J]. 安徽農業科學， 2013， 41（8）： 3350-3351， 3417.

[17] 魏進莉， 李麗芳， 于學斌. 紫葉狼尾草的組織培養與快速繁殖[J]. 植物生理學報， 2015， 51（2）： 207-211.