響應面試驗優化超聲輔助法提取黃秋葵多糖工藝及對多糖脫色工藝的研究

孫 晗，謝春陽，傅俊曦，孟令志，張雅捷，夏 寧

(吉林農業大學 食品科學與工程學院,吉林 長春 130118)

黃秋葵為錦葵科秋葵屬，最早的栽培技術起源于埃及，一般認為發源于非洲，是非洲和印度部分地區飲食中不可分割的一部分。因其具有促進健康的功效，在世界各地都被廣泛種植并作為食品和民間藥物[1～3]。黃秋葵(Abelmoschus esculentus L.Moench)，也稱秋葵、羊角菜、補腎草，為一年生草本植物[4]。其嫩莢中含有大量的黏性多糖物質，主要成分包括果膠多糖、阿拉伯聚糖、半乳聚糖及少量糖蛋白[5,6]。此外，還含有豐富的L-半乳糖醛酸、鼠李糖、D-半乳糖和葡萄糖[7]。黃秋葵根、莖、葉、花、果實、皆可以食用，其豆莢長期以來一直被用作蔬菜和膳食藥物的來源[8～10]，同時也可作為治療痢疾，腹瀉等多種疾病的傳統藥物[11]，主要具有促進人體消化吸收、提高免疫力、抗炎癥、降血糖、抗氧化、治療皮膚癌及降低高脂飲食誘導的肥胖等功效[12～13]。它的種子，花等部位富含類黃銅、多酚、果膠、維生素，氨基酸等營養物質，可作為功能性食品食用[14]。黃秋葵最突出的特點是粘液，可以起到促進消化、防止便秘、促進膽固醇物質排出體外、潤滑關節、增強抵抗力，緩解疲勞等功效[15]，而它的豆莢常被用作為粘性食物來對抗胃炎[16]。一般來說，黃秋葵中主要能促進健康的物質稱為多糖[17]，秋葵多糖是一種非凝膠性的多糖[18]可作為增稠劑、乳化劑、穩定劑、黏合劑等在食品工業中應用[19～20]，且具有較強的清除自由基和抗氧化活性[21]，而秋葵凝膠是從葵花科木槿果實中提取出來的陰離子聚合物[22]。近年來主要集中在天然多糖的研究上，秋葵多糖被稱為女士的手指，是一種經濟型的蔬菜，在中國民間治療利尿，胃潰瘍，腸結炎[23]，具有很大的研究價值。多糖是天然大分子物質，具有多種生物活性，如抑制自由基、抗腫瘤，抗癌等，其生物性功能已成為現代化醫學和食品功能化學一個關注的焦點[24～25]。

近年來，從植物、動物和微生物中提取的多糖已成為研究的一個重要領域[26]。目前，關于植物多糖的提取方法有超聲提取法、水提醇沉法、微波輔助萃取法和酶法等，而超聲提取作為綠色提取方法已經廣泛用于加速多糖的提取過程[27]。多糖的產量往往取決于提取方法的不同，水提醇沉法耗時長，超聲提取對溶劑要求相對較高，成本高[28]，相比于前兩種方法，采用超聲輔助水提法可彌補兩者缺點。黃秋葵莖中含有大量的色素，導致提取的多糖顏色較深，因此需對秋葵多糖進行脫色處理。脫色是多糖精致的重要步驟之一，傳統的吸附方法有過氧化氫吸附法，活性炭吸附法和大孔吸附樹脂吸附法[29～30]。活性炭脫色法效果明顯但多糖保留率相對較低，H2O2脫色效果好但容易使多糖氧化變質，大孔吸附樹脂不影響多糖結構但脫色效果不如H2O2，具體應根據后期對提取多糖的應用去合理選擇提取方法。新型大孔吸附樹脂近幾年被廣泛使用研究，在多糖脫色研究上具有很好的應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮黃秋葵, 山東青島；無水乙醇, 天津富宇化工；苯酚, 天津大茂試劑;

濃硫酸, 北京化工廠；無水葡萄糖, 國藥試劑；D101大孔吸附樹脂, 國藥試劑。

1.2 儀器與設備

HX1002T電子分析天平, 慈溪市天東衡器廠；HH-2數顯恒溫水浴鍋, 常州朗越儀器制造有限公司；L2-4K臺式離心機, 安徽中科中佳科學儀器有限公司；XD-2000A型旋轉蒸發儀, 上海賢德試驗儀器；JY92-Ⅱ超聲細胞破碎機, 寧波新芝生物科技股份有限公司；101-2A電熱鼓風干燥箱, 上海一恒科技有限公司；T6新世紀紫外可見分光光度光度計, 天津天泰儀器。

1.3 試驗方法

1.3.1 苯酚-硫酸法測定多糖含量標準曲線 根據苯酚硫酸法測定的吸光值繪制葡萄糖標準曲線。

1.3.2 秋葵多糖提取工藝流程 新鮮黃秋葵—鼓風干燥—粉碎—過篩—超聲輔助水提—離心(4 000 r/min)(取上清液)—旋蒸濃縮—無水乙醇醇沉過夜—二次離心(4 000 r/min)(棄上清液)—烘干—秋葵多糖。

1.3.3 秋葵多糖提取工藝操作要點 主要有:

原料預處理：選取新鮮飽滿的黃秋葵果實，除蒂。

干燥：將新鮮黃秋葵切分成2～3 cm的小段，擺放均勻，放入鼓風干燥機，直至干燥至恒重。

粉碎過篩：利用破碎機將秋葵打粉，反復過60目篩，平均出粉率達11%

離心：將多糖溶液放入離心機內以4 000 r/s速度離心，離心后取多糖上清液

濃縮：將上清液濃縮至原體積的1/3。

二次離心：加入與濃縮液等體積的無水乙醇醇沉過夜。

式中：E-多糖得率；C-吸光值對應濃度；V-體積；N-稀釋倍數；M-秋葵粉質量

1.3.5 脫蛋白處理 脫蛋白：采用sevage試劑法脫蛋白處理，配置sevage試劑(三氯甲烷∶正丁醇=4∶1)，置于分液漏斗中劇烈震蕩直至分層，取上層液，脫蛋白過程中可脫去少許顏色。

1.4 超聲輔助水提醇沉法提取秋葵多糖單因素試驗

以料液比，超聲時間，水提溫度為單因素，進行三因素三水平響應面試驗，并重復三次試驗。

1.4.1 料液比試驗 稱取1 g秋葵多糖粉，溶于一定量蒸餾水中，當水提溫度為70℃，超聲時間為40 min的條件下，其料液比(g/ml)分別選取1∶35,1∶40,1∶45,1∶50,1∶55,1∶60,1∶65進行試驗。

1.4.2 超聲時間試驗 稱取1 g秋葵多糖粉，溶于一定量蒸餾水中，當水提溫度為70℃，料液比為1∶50的條件下，其超聲時間分別選取25 min，30 min，35 min，40 min，45 min，50 min，55 min進行試驗。

1.4.3 水提溫度試驗 稱取1 g秋葵多糖粉，溶于一定量蒸餾水中，當料液比為1∶50，超聲時間為40 min，水提溫度分別選取40℃，50℃，60℃，70℃，80℃，90℃，100℃進行試驗。

1.5 超聲波輔助水提醇沉法提取秋葵多糖響應面試驗

以秋葵粗多糖得率為響應值進行三因素三水平的響應面試驗，對超聲波輔助水提醇沉法提取秋葵粗多糖的工藝條件進行優化。

表1 超聲波提取響應面因素水平

1.6 D101大孔吸附樹脂脫色方法

1.6.1 大孔樹脂預處理 配置相同濃度的 NaoH溶液和 HCL溶液，分別浸泡D101大孔吸附樹脂，并用蒸餾水沖洗直至樹脂呈中性，真空抽氣活化后備用。

1.6.2 D101大孔吸附樹脂脫色單因素試驗 以D101大孔吸附樹脂用量，脫色時間，脫色溫度為單因素，進行三因素三水平正交試驗。在490 nm處測定吸光值，計算脫色率，再利用苯酚—硫酸法測定粗多糖含量，從而測定多糖保留率，并進行三次平行試驗，計算誤差。

1.6.3 D101大孔吸附樹脂用量 配置濃度為1%的秋葵多糖溶液，并用量筒量取多糖溶液30 mL，固定脫色溫度為40℃，脫色時間為2 h，設置大孔樹脂用量為1%，1.5%，2%，2.5%，3%進行脫色，離心，取上清液。

1.6.4 脫色溫度選擇 配置濃度為1%的秋葵多糖溶液，并用量筒量取多糖溶液30 mL，固定D101大孔吸附樹脂用量為2%，脫色時間2h，設置脫色溫度為20℃，30℃，40℃，50℃，60℃進行脫色，離心，取上清液。

1.6.5 脫色時間選擇 配置濃度為1%的秋葵多糖溶液，并用量筒量取多糖溶液30 mL，固定D101大孔吸附樹脂用量為2%，脫色溫度40℃，設置脫色時間為1 h，1.5 h，2 h，2.5 h，3 h，離心，取上清液。

1.7 D101大孔吸附樹脂脫色正交試驗

表2 D101大孔吸附樹脂脫色正交試驗因素水平

1.8 脫色率計算公式

式中：D2為脫色率，%；OD0為原樣品的吸光值；OD1為處理后的吸光值。

1.8.1 多糖保留率計算公式 采用上述苯酚硫酸法測定多糖含量。

M=C×V×10-6

式中：M為多糖質量，g；C為多糖的質量濃度，mg/mL；V為多糖溶液體積，mL。

多糖保留率：

式中：D3為多糖保留率，%；M3為脫色后多糖含量，g；M2為樣品多糖含量，g。

1.8.2 綜合評分計算公式

式中：F為綜合評分；D2為脫色率，%；D3為多糖保留率，%。

2 結果與分析

2.1 苯酚-硫酸法測定多糖含量標準曲線回歸方程

2.2 超聲波輔助水提醇沉法提取粗多糖單因素試驗結果

2.2.1 超聲時間對粗多糖得率的影響 由圖2可知，多糖得率在超聲時間為40 min時達到峰值，在25～40 min時逐步上升，在40～55 min時逐步下降，可能是因為時間過長，超聲波對多糖結構產生破壞作用，從而使多糖得率下降。

圖1 多糖含量測定標準曲線

圖2 超聲時間對粗多糖得率的影響

2.2.2 液料比對粗多糖得率的影響 由圖3可知，多糖得率在液料比為50∶1(mL/g)條件下達到峰值，在35∶1～50∶1時逐步上升，在50～65min時逐步下降，可能是因為蒸餾水變多，多糖被充分溶解，但蒸餾水過多會導致秋葵中其他雜質析出，從而使多糖得率下降。

圖3 液料比對粗多糖得率的影響

2.2.3 水提溫度對粗多糖得率的影響 由圖4可知，多糖得率在水提溫度為70℃時達到峰值，在40～70℃時逐步上升，70～100℃時逐步下降，可能是因為溫度上升，多糖被充分溶解，但溫度過高會導致多糖結果受熱變性，從而使多糖得率下降。

圖4 水提溫度對粗多糖得率的影響

2.3 超聲波輔助水提醇沉法提取秋葵粗多糖響應面優化試驗結果

表3 響應面分析結果

2.4 顯著性分析結果

從表4可以看出該回歸模型極顯著，失擬項不顯著，方程對于該試驗擬合度良好，該試驗方法可行。分析得出主次因素：料液比(A)>超聲時間(C)>水提溫度(B)。回歸系數為0.9877，調整系數為0.9719，數值相近，準確性可行。建立二次回歸方程：Y=6.68-0.046A+0.22B-0.14C-0.05AB+0.19AC+0.037BC-0.54A2-0.51B2-0.37C2。

表4 回歸模型方差分析

顯著性分析：一次項顯著性分析：A影響顯著，B,C影響極顯著；二次項顯著性分析：A2,B2,C2影響極顯著；交互項顯著性分析：AC影響極顯著。

響應面分析結果見圖5～圖7。

圖5 超聲時間與水體溫度對多糖提取率影響的響應面和等高線

圖6 超聲時間與料液比對多糖提取率影響的響應面和等高線

圖7 水提溫度與料液比對多糖提取率影響的響應面和等高線

得出結論：最優工藝條件為：水提溫度68.08℃，超聲時間41.05 min，液料比49.56(mL/mg)，秋葵多糖得率為6.71%。

2.5 D101大孔樹脂脫色單因素試驗結果

2.5.1 D101大孔樹脂用量對脫色率和多糖保留率的影響 由圖8可知，隨著D101大孔樹脂用量的增加，多糖脫色效果越來越好，但多糖保留率呈現下降趨勢，可能原因是隨著大孔樹脂用量的增加，溶劑接觸面增大，色素能夠更好的被吸收，綜合考慮選擇最佳D101大孔樹脂用量范圍為1%～3%。

圖8 D101大孔樹脂用量對脫色率多糖保留率的影響

2.5.2 脫色時間對脫色率和多糖保留率的影響 由圖9可知，隨著脫色時間增加，多糖脫色效果越來越好，但多糖保留率呈現下降趨勢，可能是由于時間的延長，色素和多糖長時間被樹脂吸附，從而能夠被更好的吸收。綜合考慮選擇最佳脫色時間范圍為1～2 h。

圖9 脫色時間對脫色率多糖保留率的影響

2.5.3 溫度對脫色率和多糖保留率的影響 由圖10可知，隨著脫色溫度的升高，色素被更好的吸收，脫色效果遞增，同時多糖保留率遞減，可能是由于溫度升高有利于分子運動，使色素充分吸收，而保留率低可能是由于高溫使多糖結構破壞，綜合考慮選擇最佳脫色溫度范圍為20～40℃。單因素脫色效果相對較低，還有一部分原因是前一部分對多糖進行脫蛋白處理過程中導致色素部分被脫去。

圖10 脫色溫度對脫色率多糖保留率的影響

2.6 D101大孔樹脂脫色脫色正交試驗結果(表6)2.7 驗證試驗

表6 正交試驗結果

根據響應面試驗結果，得出多糖得率為6.71%。進行三次驗證試驗，得出多糖平均得率為6.62%，樹值接近，結果可靠。

根據正交試驗結果，得出多糖脫色率為38.05%，保留率為90.76%。進行三次驗證試驗，得出多糖平均脫色率為37.88%，平均保留率為90.23%，數值接近，結果可靠。

3 結論

秋葵多糖富含豐富的營養物質，有抗氧化，抗疲勞，抗炎癥、促進腸胃蠕動、潤滑關節以及抗癌等多種功效，但目前國內外對于秋葵多糖的研究主要集中在多糖的抗氧化作用，多用于小鼠實驗。而秋葵多糖是一種可再生并且價格便宜的可生物降解多糖，具有水溶性好、透明度高、可塑性強、黏性高的特點，所以還是一種理想的成膜原料。目前國內外對于秋葵多糖做可食膜的研究還尚未發現，因此為今后做可食膜奠定了一定的基礎，具有很大的研究和應用價值。秋葵多糖是一種粘性多糖，其粘液透明度高，拉伸性好，由此做成的可食膜可以幫助解決目前可食膜拉伸性能差的特點，而利用其抗氧化性，可以將其做成抗氧化抑菌類的可食膜。由于提取的秋葵多糖顏色較深，如若后期應用于制作可食膜，為了不影響外觀，需對其進行脫色處理，而目前國內外對于多糖脫色方法有三種，即活性炭、過氧化氫和大孔樹脂脫色法。而對于多糖的脫色方法，國內外目前多用選用活性炭，對大孔樹脂的研究相對較少。筆者選用一種新型大孔吸附樹脂D101，研究它的吸附能力對秋葵多糖的脫色效果和脫色后多糖保留效果。使用大孔吸附樹脂要嚴格注意其活化步驟，若活化不好或不完全，會嚴重影響其吸附色素的能力。筆者用新型大孔吸附樹脂對多糖脫色工藝進行研究以及對后續用秋葵多糖制備可食膜的研究奠定了一定的理論基礎。