豬流行性腹瀉病毒滅活疫苗臨床免疫效果評價

劉德琴 ，肖 敏 ，盧 昌 ，曹華斌 ，劉 建

（1.江西正邦養殖有限公司，江西 南昌 330096；2.江西正邦農業科學院，江西 南昌 330096；3.江西農業大學，江西 南昌 330045）

豬流行性腹瀉（Porcine Epidemic Diarrhea，PED） 是 由 豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）引起豬的腹瀉、嘔吐、脫水及對仔豬高致死率的一種接觸性腸道傳染病，豬即使耐過也會降低經濟效益。20世紀80年代初PED在我國陸續發生，目前不同階段不同品系的豬只，對此病均有高度易感性，仔豬死亡率高達80%～100%。自2010年末開始，我國豬場陸續暴發了由PEDV變異毒株引起的“頑固性腹瀉”疫情，嚴重影響我國養豬業健康發展，給我國養豬業造成巨大經濟損失。由于PED在現階段未有特效藥能夠治療，在養殖管理中，仔豬免疫防治工作尤為重要。但PEDV的S和M基因可引發較多變異，蔣新華等、德西措姆等、張月等分別對江西地區、四川地區和山東地區的PED病料測序，發現各地分離的毒株與早期疫苗株同源性較遠。因此，篩選和培育出具有良好免疫原性、高毒價的毒株是疫苗研制成功的關鍵。本項目組近年來長期監測腹瀉疫情的發生，追蹤變異的PEDV毒株，以臨床分離培養的變異毒株作為候選株，有針對性地開展疫苗研發，為豬流行性腹瀉免疫防控提供試驗基礎。

1 材料

采集20個發病場病料，發病豬小腸組織經組織勻漿后，采用0.22 μm無菌過濾器（購自廣州潔特生物技術有限公司），過濾后置于-20℃保存備用。試驗豬場選取試驗母豬80頭及其所產仔豬。

2 方法

2.1 PEDV分離鑒定

將發病豬小腸組織勻漿濾液接入單層培養的Vero細胞內，加入含有胰酶的DMEM培養基，持續培養72 h，收獲培養物作為種毒進行傳代，收集細胞毒。經連續傳代5代后，以RT-PCR法鑒定上清液中是否存在PEDV病毒。對已分離的石新某場、浛洸某場和永佳河某場毒株，擴增其S1基因序列，通過MegAlign等生物信息軟件，對氨基酸同源性進化樹分析。

2.2 PEDV疫苗的研制

將擴增的細胞毒通過超濾濃縮法進行濃縮，滅活后對病毒進行無菌檢測，同時接種以無血清細胞懸浮培養技術和去除蛋白技術培養的Vero細胞，確定無細胞病變，滅活完全，與佐劑以體積1∶1比例均勻混合，利用生物反應器微載體細胞培養技術代替轉瓶細胞培養技術，制備PEDV滅活疫苗。按《中國獸藥典》和《中華人民共和國獸用生物制品質量標準》要求，對疫苗進行各項檢測。

2.3 免疫與攻毒保護試驗

試驗豬場80頭母豬隨機分成4組，每組20頭，即商品苗組（細胞苗）、組織苗組（公司某陽性發病場小腸組織制備）、細胞苗A組（永佳河：公司湖北某場分離毒+公司廣東某場分離毒）和細胞苗B組（永佳河+公司東北某場分離毒）。所有組豬只PEDV疫苗按照產前6、4、2周經后海穴注射進行免疫，其他疫苗按照豬場的常規免疫程序進行免疫，在相同的飼養管理條件下進行。母乳飼養5 d后，每頭仔豬口服攻毒（永佳河），劑量為10-7.0TCID50/0.1 mL、每頭仔豬口服2 mL。攻毒后觀察7 d，記錄試驗仔豬發病（嘔吐、水樣腹瀉）及死亡情況，采集腹瀉仔豬糞便，進行PEDV抗原RT-PCR檢測。攻毒試驗分組情況見表1。

表1 PEDV疫苗免疫保護攻毒試驗分組方案

3 結果與分析

3.1 PEDV分離鑒定

經鑒定，永佳河某場、廣東某場、東北某場的病料檢測結果、傳代鑒定均為陽性，且在分離后出現典型病變。根據測序結果表明：廣東某場（hanguang-2016）、東北某場（Shixin-2017）和永佳河某場（Yongjiahe-2015）與國內外流行毒株聚在一簇，都是變異毒株，3個毒株分別落在不同分支上，并且相互之間的氨基酸同源性低于98%，變異明顯。其分屬不同片區，所以認為不同片區所流行的毒株存在差異。永佳河某場分離毒株序列接近目前國內流行毒株，因此構建廣東某場+永佳河和東北某場+永佳河的二價疫苗組合（見圖1、圖2）。

圖1 廣東某場、東北某場和永佳河S1基因氨基酸同源性比較

圖2 廣東某場、東北某場和永佳河S1基因氨基酸進化分析結果

3.2 PEDV疫苗的研制

利用生物反應器微載體細胞培養技術代替轉瓶細胞培養技術制備的PEDV滅活疫苗成品，抗原滴度可到達10-7TCID50/0.1 mL。滅活疫苗無菌檢驗、外源病毒檢驗等各項質量檢驗均符合相關標準。

3.3 動物試驗結果

3.3.1 母豬排毒量

母豬再感染后第2天出現排毒現象（見圖3），第4天后組織苗和細胞苗B組排毒量較高，直至無檢出。

圖3 母豬再感染排毒情況

3.3.2 母豬初乳中SIgA抗體效價

四組疫苗免疫后母豬抗體都呈陽性，商品苗抗體水平基本穩定，組織苗第3天抗體水平顯著上升（P＜0.05），細胞苗A組和細胞苗B組抗體水平持續較高（見圖4）。

圖4 免疫母豬初乳中SIgA抗體檢測結果

3.3.3 臨床觀察

攻毒后連續觀察194 h，仔豬出現腹瀉判斷為發病。細胞苗B組腹瀉持續時間最短為132 h。攻毒后商品苗組首先出現死亡，死亡率12.5%，組織苗組死亡率2.5%，細胞苗A組死亡率0，細胞苗B組死亡率10%（見圖5、圖6、圖7）。

圖5 免疫母豬所產仔豬的發病率

圖6 仔豬腹瀉死亡率

圖7 仔豬攻毒后腹瀉指數

3.3.4 仔豬排毒量

商品苗排毒時間較長，排毒量偏高；細胞苗A組和細胞苗B組排毒持續時間較短，排毒量較少（見圖8）。

圖8 仔豬排毒情況

4 討論與結論

PED的防治始于組織滅活苗，但其保護率較差且難以控制，逐漸被淘汰。馬思奇等使用PEDV的CV777制備的細胞滅活苗使仔豬獲得較好的免疫保護率。雖然PEDV只有一個血清型，但我們通過對各地分離的毒株進行基因序列測定，證明很多都是變異毒株，與傳統毒株基因差異較大。PEDV毒株的基因變異應該是造成免疫失敗和仔豬死亡率高的主要原因。

本項目利用無血清細胞懸浮培養技術和去除蛋白技術、生物反應器微載體細胞培養技術代替轉瓶細胞培養技術及先進的片狀載體培養工藝進行PEDV細胞滅活苗的制備，解決了生產效率低、產品質量不穩定、病毒效價低的問題。通過生產技術和生產工藝的改變，提高病毒單位培養效價10～30倍。疫苗的免疫原性、抗原含量等指標都達到國內商品疫苗的水平，抗原含量≥10-7.5TCID50/0.1 mL，高于同類產品。SIgA抗體的水平和均勻度明顯高于國內水平，正如白翠認為的仔豬主要通過初乳及奶液獲得母源SIgA。免疫保護試驗證明本項目疫苗對仔豬具有較好的免疫保護率。檢測產后母豬血清及初乳中的抗體的保護效價水平，本試驗滅活疫苗保護率明顯高于其他組，確定該滅活疫苗具有高特異性保護能力。

綜上所述，本項目研發的豬流行性腹瀉細胞滅活苗應用于不同片區豬場分離的變異毒株，具有滴度穩定和均一、易純化等特點，獲得比市場疫苗較好的免疫保護效果，能有效減少仔豬死亡率和提高母豬初乳的抗體水平。