高壓氧修復缺血再灌注損傷大鼠血腦屏障的自噬機制

黃菲菲，王萬松，董曉陽，馮珍

1.皖南醫學院弋磯山醫院康復醫學科，安徽蕪湖市 241000；2.南昌大學第一附屬醫院康復醫學科，江西南昌市 330006

0 引言

隨著我國人口的老齡化，腦血管疾病已成為危及人們健康和生命的重大疾病之一[1]。腦梗死又稱缺血性腦血管病，在老年人群中具有較高的發病率、致殘率和致死率，對患者的神經功能和日常生活能力造成嚴重影響，也給國家和社會帶來巨大的經濟負擔[2]。腦梗死后血腦屏障往往會遭到破壞，進而引起炎性細胞及其介質的內流，加速腦水腫、出血的形成[3]。腦微血管內皮細胞是血腦屏障重要的組成部分，在腦缺血再灌注損傷(cerebral-ischemica reperfusion injury,CIRI)后存在自噬現象，且這種現象可以減輕缺血再灌注損傷后血腦屏障的破壞[4]，表明血管內皮細胞自噬對CIRI后的血腦屏障能起到保護作用。

高壓氧艙治療目前在臨床上主要適用于減壓病、急性一氧化碳中毒、糖尿病感染性潰瘍、危兆皮瓣等疾病[5]。近年來的臨床研究顯示[6-8]，高壓氧艙治療在腦卒中患者神經功能缺損、生活質量及抑郁癥狀等方面發揮積極作用。高壓氧能夠減輕腦梗死大鼠血腦屏障的通透性，降低缺血缺氧對神經細胞的損害[9]，且能夠增強梗死區神經細胞的自噬，發揮神經保護作用[10]。然而，高壓氧是否能夠調控腦梗死區血管內皮細胞的自噬以及是通過何種機制發揮修復血腦屏障的作用目前仍不明確。

本實驗研究高壓氧對腦梗死大鼠腦血管內皮細胞自噬的影響，并明確細胞自噬是否介導高壓氧修復血腦屏障的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF 級成年雌性Sprague-Dawley 大鼠54 只，體質量230～250 g，購自南昌大學實驗動物科學中心，許可證號SYXK(贛)2015-0001。適應性喂養1 周后開始實驗。大鼠編號，采用Excel 軟件生成隨機數，隨機分為假手術組(n=12)、模型組(n=18)、高壓氧組(n=12)和抑制劑組(n=12)。

假手術組僅麻醉和手術暴露頸總動脈，不做栓塞處理；模型組建立CIRI模型；高壓氧組在建模后予以高壓氧艙治療；抑制劑組在建模后先經腦立體定位儀，往側腦室內注射自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)后再給予高壓氧艙治療。

所有操作均符合中華人民共和國《實驗動物管理條例》。大鼠依照動物福利與倫理原則進行處理，遵循2006 年《關于善待實驗動物的指導性意見》執行。實驗方案經南昌大學第一附屬醫院醫學研究倫理委員會審批〔No.(2016)醫研倫審第(003)號〕。

1.2 主要儀器和試劑

兔抗LC3 多克隆抗體(AP1802a)：百齊生物科技有限公司。小鼠抗CD31單克隆抗體(ab64543)、Alexa Flour?594標記的驢抗小鼠IgG(ab150108)：ABCAM有限公司。FITC 標記山羊抗兔IgG(HS111)：北京全式金生物技術有限公司。兔抗Beclin-1 多克隆抗體(3738)：CELL SIGNALING 生物公司。組織蛋白提取試劑盒(CWBl0)、抗β-actin 單克隆抗體(CW0096)：北京康為世紀生物科技有限公司。細胞自噬抑制劑3-MA(M9281)：SIGMA-ALDRICH 公司。ZS-BS 數顯腦立體定位儀：北京眾實迪創科技發展有限公司。冰凍切片機、熒光倒置顯微鏡、熒光分光光度儀由南昌大學基礎實驗室提供，高壓氧艙由南昌大學第一附屬醫院康復醫學科提供。

1.3 動物模型建立

采用線栓法[11]制備CIRI模型。10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠。頸正中切口，長約3 cm，暴露右頸總動脈，自制拉鉤牽拉肌肉，暴露頸總動脈和頸內/頸外動脈的分叉處。鈍性分離血管神經鞘膜，距頸內/頸外動脈分叉處2 mm 左右剪一小切口，結扎頸外動脈，夾閉頸總動脈和頸內動脈。持栓線沿頸外動脈緩慢進入頸內動脈直至遇阻力，再輕輕向前用力插緊，結扎頸外動脈，栓線入口后松開頸總動脈微型血管夾。梗死2 h 后，解開切口，將栓線緩慢拔出，結扎頸外動脈殘端。6 h 后，對大鼠進行改良神經功能缺損評分(modified Neurological Severity Score,mNSS)[12]。mNSS 評分由運動、感覺、平衡和反射等測試組成，總分0～18分，分數越高，神經行為損傷越嚴重，將7～12分的大鼠納入實驗。

1.4 高壓氧艙治療

缺血再灌注損傷后6 h 將高壓氧組和抑制劑組置于自制透明密閉塑料箱中[13]，箱子兩側分別設有單向進氣口和出氣口，再將整個裝置連同大鼠一同放置于高壓氧艙中，壓力設定為2.5 個標準大氣壓，穩壓前5 min 以10 L/min 的流速直排式向塑料箱內給氧，持續1 h，艙內的溫度控制在23～26 ℃，所有動物治療開始的時間都選擇在一天中的同一時刻。連續治療3 d。模型組僅置于正常空氣的艙內，不進行高壓氧艙治療。

1.5 側腦室注射

抑制劑組在建模后1 h，10%水合氯醛3 mL/kg 腹腔麻醉，俯臥于三維腦立體定位儀上，固定四肢和頭部，暴露顱骨，標記基點(正中線旁開1.5 mm，前囟后約1.0 mm)，用顱骨鉆在基點處鉆一小孔，將25 μL的微量注射器固定，進針深度為距硬腦膜下3.8 mm，以0.5 μL/min的速度向右側腦室注射3-MA(30 μg溶于10 μL 生理鹽水中)，共5 min，注射結束后留針5 min后再退針。

1.6 血腦屏障通透性檢測

采用伊文思藍染色法檢測血腦屏障通透性[14]。每組取6 只大鼠于術后72 h 檢測梗死區伊文思藍含量。2%伊文思藍2 mL/kg 經尾靜脈注，1 h 后心臟灌注生理鹽水直至流出清澈液體，立即處死大鼠取出腦組織，分離缺血側大腦，生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干表面水分，稱量濕重后置于試管中，加入甲酰胺3 mL，45 ℃水浴48 h，10 000 r/min 離心20 min，取上清液，熒光分光光度計632 nm處測量吸光度值。

1.7 免疫熒光雙標檢測

模型組取6 只大鼠，術后72 h，10%水合氯醛3 mL/kg腹腔麻醉，4%多聚甲醛經心臟灌注致大鼠全身僵硬，處死大鼠并立即取出全腦，投入試管中，加入4%多聚甲醛再次固定12 h，分別置于20%、30%葡萄糖梯度脫水，-20 ℃冰凍切片，片厚10 μm，-80 ℃保存備用。取出切片在室溫下平衡30 min，4%多聚甲醛固定30 min，磷酸緩沖液沖洗后加入0.3%Triton破膜，洗膜后加入封閉血清，37 ℃環境下孵育1 h。兔抗LC3 多克隆抗體(1∶50)與小鼠抗大鼠CD31單克隆抗體(1∶100)混合后，滴加到腦組織上，4 ℃孵育過夜。第2 天將切片37 ℃復溫1 h，磷酸緩沖液沖洗后，在避光條件下滴加Alexa Flour?594 標記的驢抗小鼠IgG(紅光)和FITC 標記山羊抗兔IgG(綠光)的混合二抗稀釋液(1∶200)，37 ℃孵育2 h 后磷酸緩沖液沖洗，抗熒光衰減封片劑封片。熒光顯微鏡下觀察并照相。

1.8 Western blotting

每組取6 只大鼠，于缺血再灌注損傷后72 h，10%水合氯醛3 mL/kg 腹腔麻醉，斷頭取腦，在冰盒上切取梗死區腦皮質，迅速置于液氮中。取0.1 g腦皮質，加入0.1% Ⅱ型膠原酶，混勻后置37 ℃溫水中消化1.5 h，12 000 r/min 離心5 min 后去除上清液，加入15%葡聚糖同法離心得到微血管段，再加10倍體積的裂解緩沖液，同法離心取上清液，加入樣品緩沖液，沸水浴5 min。蛋白樣品在15%的SDS-PAGE 凝膠中分離后，轉移至PVDF 膜上，加兔抗LC3 多克隆抗體(1∶1000)或兔抗Beclin-1 多克隆抗體(1∶1000)，4 ℃孵育過夜。山羊抗兔IgG (1∶3000)室溫孵育2 h 后，凝膠成像分析系統掃描拍照，Image Lab 軟件定量分析，以LC3-Ⅱ與LC3-I的比值和Beclin-1/β-acting 的比值分別表示LC3-Ⅱ和Beclin-1的蛋白表達水平。

1.9 統計學分析

采用統計軟件SPSS 17.0 進行統計學分析。伊文思藍含量、LC3-Ⅱ與Beclin-1 蛋白表達水平符合正態分布，以()表示，采用單因素方差分析，顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 伊文思藍含量

經尾靜脈注射伊文思藍后大鼠全身皮膚、鞏膜迅速變藍。全身循環1 h 后，右側梗死區著色明顯。各組患側腦組織伊文思藍含量比較有非常高度顯著性差異(P＜0.001)。模型組較假手術組明顯升高(P＜0.01)；高壓氧組較模型組明顯降低(P＜0.01)，抑制劑組較高壓氧組升高(P＜0.05)，模型組與抑制劑組比較無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

表1 各組患側腦組織EB含量的比較單位：μg/g腦組織

2.2 免疫熒光雙標檢測

CIRI后72 h，模型組缺血周圍腦皮質區可見LC3(綠光)在CD31+的血管內皮細胞(紅光)上表達(圖中白色箭頭所指)。見圖1。

圖1 模型組LC3、CD31免疫熒光染色結果(×100)

2.3 Western blotting

CIRI后72 h，與假手術組比較，模型組LC3-Ⅱ和Beclin-1 的表達水平均明顯升高(P＜0.01)；與模型組比較，高壓氧組LC3-Ⅱ和Beclin-1 蛋白表達水平升高(P＜0.05)，而抑制劑組較高壓氧組和模型組均明顯降低(P＜0.01)，假手術組與抑制劑組的比較無顯著性差異(P ＞0.05)。見圖2、表2。

表2 各組間LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達水平的比較

圖2 各組大腦皮質微血管段LC3和Beclin-1的表達(Western blotting)

3 討論

細胞自噬是通過溶酶體降解途徑消化去除細胞分子，如蛋白質聚集體和受損的細胞器?；钚匝跏羌毎x的產物，過度產生會導致細胞的氧化損傷，從而導致細胞死亡；自噬通過降解氧化物質，可以減少細胞損傷[15]。LC3 是自噬形成的標記蛋白[16]，自噬發生時，胞漿型LC3(LC3-I)會轉變成自噬體膜型LC3(LC3-Ⅱ)，LC3-Ⅱ表達的水平與自噬程度呈正比[17]。Beclin-1 是自噬形成的主要調節因子，能誘導自噬蛋白定位于吞噬泡，對自噬體的形成和成熟至關重要[18]。細胞在正常內環境下的自噬水平較低，當其受到刺激(如氧化應激、缺血缺氧等)自噬會被激活[19-20]。缺血再灌注損傷大鼠大腦頂葉的LC3-Ⅱ表達增加，且損傷后24 h表達最高[21]。

免疫熒光雙標結果提示，大鼠腦缺血再灌注損傷后，腦血管內皮細胞存在自噬現象。Western blotting定量分析結果表明，缺血再灌注損傷后大鼠血管內皮細胞自噬水平增強，且高壓氧能夠進一步增強腦血管內皮細胞自噬，自噬抑制劑則能抑制高壓氧的這一效應。

腦微血管內皮細胞及其緊密連接組成血腦屏障的重要結構[22]。大腦發生缺血后，外周的免疫細胞和分子滲入并積聚到腦實質，血管內皮緊密連接的破壞和通透性的增加，是導致血腦屏障功能障礙和損傷進展的重要原因[23-24]。腦血管內皮細胞自噬能夠降低伊文思藍在內皮細胞的著色和缺血半球的腦含水量[4]。Fang 等[25]稱自噬抑制劑能夠加劇丙酮醛對人腦血管內皮細胞的損害，且氯喹誘導的自噬被抑制后糖尿病大鼠的血腦屏障的通透性也增加。這與本實驗的結果一致。

目前研究已證實高壓氧對腦缺血的神經保護作用，包括減少梗死面積，緩解腦水腫，減輕局灶神經功能缺損癥狀，改善急性腦梗死預后等[26-29]。以往研究表明高壓氧主要是通過以下機制發揮療效。①調節免疫炎癥。高壓氧能夠刺激內源性抗氧化和抗炎防御系統，從而降低氧化損傷和炎癥級聯反應[30]。②抑制細胞凋亡。高壓氧能夠抑制缺血/缺氧誘導的線粒體凋亡和能量代謝紊亂，阻止腦細胞損傷的進展[31]。③促進神經營養因子的表達，起到營養細胞的作用[32]。④刺激細胞自噬的形成[10,33]，減少細胞的損傷或凋亡。⑤修復血腦屏障[34]，減少炎性細胞及其介質的內流對腦組織造成的二次損傷[35]。本實驗顯示，高壓氧可通過增強血管內皮細胞自噬，減輕血管內皮細胞壞死和損傷，起到保護血腦屏障的作用，減輕繼發性損傷，起到神經保護作用。

綜上所述，缺血再灌注損傷大鼠損傷區的血管內皮細胞存在自噬現象。高壓氧能夠上調腦缺血再灌注損傷大鼠血管內皮細胞的自噬，促進血腦屏障修復。

本實驗只研究了缺血再灌注損傷后6 h 的高壓氧治療，其他時間窗的介入可能會引起不同的結果。未來還可采用其他檢測手段，包括電鏡下觀察自噬體的形成等，進一步確定高壓氧對腦梗死大鼠的神經保護機制。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。