一例蛋雞沙門(mén)氏菌和大腸桿菌混合感染的實(shí)驗(yàn)室診斷

張應(yīng)斌

（濟(jì)南市鋼城區(qū)艾山街道辦事處畜牧獸醫(yī)站，濟(jì)南 271104）

蛋雞沙門(mén)氏菌是一種可通過(guò)水平接觸或種蛋垂直傳播的細(xì)菌性傳染病，可感染雛雞、育成雞和成年雞等不同年齡段雞只，2～3周齡雛雞易感性高，并出現(xiàn)生長(zhǎng)遲緩[1]，而成年雞感染后會(huì)影響生殖系統(tǒng)，母雞輸卵管膨大、阻塞，卵巢萎縮、變性，公雞睪丸變小、變硬。家雞、火雞是家禽中發(fā)病率較高的品種，尤其在當(dāng)今規(guī)模化、集約化生產(chǎn)下，蛋雞沙門(mén)氏菌病在我國(guó)乃至世界各地均有流行，嚴(yán)重威脅蛋雞的健康生產(chǎn)[2]。蛋雞大腸桿菌病是一種可通過(guò)呼吸道或消化道途徑傳播的細(xì)菌性傳染病，容易因氣候驟變、長(zhǎng)途運(yùn)輸、養(yǎng)殖密度過(guò)高、驚嚇等造成蛋雞免疫功能下降，進(jìn)而感染不同日齡家禽[3]。由于不同地區(qū)蛋雞大腸桿菌致病性血清型不同，并可通過(guò)接觸進(jìn)行不同血清型交叉感染，給蛋雞生產(chǎn)造成巨大威脅。由于上述兩種細(xì)菌性傳染病具有發(fā)病率高、傳播途徑廣、易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，會(huì)增加蛋雞的死淘率，養(yǎng)殖戶必須做好該病的防控。現(xiàn)將山東省濟(jì)南市一例蛋雞大腸桿菌與沙門(mén)氏菌混合感染病例的診斷過(guò)程報(bào)道如下。

1 病例基本情況

山東省濟(jì)南市鋼城區(qū)金谷源養(yǎng)殖場(chǎng)共飼養(yǎng)蛋雞100 多只，2022 年11 月有14 只蛋雞發(fā)病，診斷前已有3只死亡。對(duì)發(fā)病蛋雞進(jìn)行臨床癥狀診斷，發(fā)現(xiàn)病雞精神不振，離群呆立，病雞食欲銳減，部分病雞腹瀉，排泄稀糞，糞便顏色為白色，病雞肛門(mén)附近的羽毛也有糞便污染。對(duì)病死雞進(jìn)行病理解剖，發(fā)現(xiàn)2只病死雞的血液凝固不良，病死雞的心包腔內(nèi)有許多淡黃色液體，心包膜及外膜表面有淡黃色的纖維膜附著，肝臟體積明顯增大，肝臟表面有許多白色或灰白色的病灶，病雞肺臟腫脹、出血。結(jié)合病雞的臨床癥狀、解剖結(jié)果初步鑒定病雞有病原菌感染的可能，然后通過(guò)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的方法對(duì)蛋雞感染的病原菌進(jìn)行鑒定。

2 實(shí)驗(yàn)室診斷

2.1 主要試劑

M.H.瓊脂培養(yǎng)基，采購(gòu)于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，采購(gòu)于默克有限公司；伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、SS 瓊脂培養(yǎng)基、革蘭氏染色液試劑盒、細(xì)菌試驗(yàn)所用的藥敏紙片，采購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；膽硫乳瓊脂、生化鑒定試驗(yàn)試劑，采購(gòu)于青島海博生物技術(shù)有限公司。

2.2 病原分離培養(yǎng)

采集病死雞的肺臟、肝臟，加入適量的生理鹽水（已滅菌）勻漿制成懸液，將懸液分別接種到麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（固體平板）、SS瓊脂培養(yǎng)基（固體平板），將其置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)經(jīng)過(guò)20 h左右的培養(yǎng)。然后從麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上挑取微紅色或桃紅色的單菌落，將其接種到伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（固體平板），37 ℃培養(yǎng)20 h后，從伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基中挑取單菌落，連同先前的SS 瓊脂培養(yǎng)基表面上的黑色單菌落分別制成涂片、革蘭氏染色、純化。

2.3 生化鑒定

將分離純化獲得病原菌分別進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)（葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、鼠李糖、山梨醇、甘露醇、蛋白胨水）、β-半乳糖苷酶試驗(yàn)（ONPG 試驗(yàn)）、3%氯化鈉三糖鐵試驗(yàn)、V-P 試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)、賴氨酸脫羧酶肉湯試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、西蒙氏枸櫞酸鹽試驗(yàn)，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，根據(jù)不同生化鑒定試驗(yàn)管培養(yǎng)時(shí)間要求進(jìn)行培養(yǎng)，然后按照生化試驗(yàn)管的生化反應(yīng)現(xiàn)象進(jìn)行鑒定。

2.4 藥敏試驗(yàn)

將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上分離、純化的大腸桿菌接種到LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)18 h后可見(jiàn)LB液體培養(yǎng)基變得渾濁，將試管搖勻，取適量渾濁菌液，加入適量生理鹽水，將菌液制成0.5 號(hào)麥?zhǔn)蠞岫葮?biāo)準(zhǔn)管濃度（1.5×108個(gè)·mL-1），然后立即用無(wú)菌棉棒蘸取菌液涂抹在M.H.瓊脂培養(yǎng)基（固體平板），15～30 s后培養(yǎng)基表面干燥，用鑷子（已滅菌）夾取不同的藥敏紙片，每個(gè)培養(yǎng)基平板放置5片藥敏紙片，紙片間的間距大于24 mm，紙片與培養(yǎng)皿邊緣間距大于15 mm，37 ℃培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行觀察，參照腸桿菌科細(xì)菌的抑菌圈直徑來(lái)判斷病原菌的藥物敏感性[4]。

3 結(jié) 果

3.1 分離培養(yǎng)的結(jié)果

3.1.1 菌落生長(zhǎng)特征

麥康凱瓊脂培養(yǎng)基：長(zhǎng)出圓形或扁平狀、表面濕潤(rùn)、邊緣整齊的微紅色或桃紅色菌落。還有另一種菌落存在，菌落形狀為圓形凸起，表面濕潤(rùn)，菌落顏色為透明或半透明狀，菌落中心的顏色變深，呈黑色。

SS 瓊脂培養(yǎng)基：長(zhǎng)出圓形、表面光滑、邊緣整齊的乳白色菌落。還有另一種菌落存在，菌落形狀為圓形凸起，表面光滑，無(wú)色透明，菌落中心呈黑色。

從麥康凱瓊脂培養(yǎng)基中挑取微紅色或桃紅色的單菌落至伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基表面，可發(fā)現(xiàn)該培養(yǎng)基上長(zhǎng)出圓形凸起、表面光滑濕潤(rùn)的深黑色或紫黑色菌落，菌落伴有金屬光澤。

3.1.2 染色結(jié)果

從伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基中挑取的單菌落染色后菌體呈紅色，菌體形狀為短小桿狀，菌體為單個(gè)、散在分布，依此可以初步判定分離菌為大腸桿菌[5]。

從SS 瓊脂培養(yǎng)基中挑取的單菌落染色后菌體呈紅色，菌體形狀為細(xì)長(zhǎng)、桿狀，單個(gè)或短鏈狀分布，可初步判定為沙門(mén)氏菌[6]。

3.2 生化鑒定的結(jié)果

大腸桿菌的鑒定結(jié)果顯示葡萄糖、麥芽糖、山梨醇、甘露醇、蛋白胨水、ONPG、甲基紅、賴氨酸脫羧酶肉湯試驗(yàn)中呈陽(yáng)性，在3%氯化鈉三糖鐵中產(chǎn)氣不產(chǎn)H2S，在乳糖、蔗糖、鼠李糖、VP、尿素酶、硫化氫、西蒙氏枸櫞酸鹽試驗(yàn)中呈陰性。見(jiàn)表1。

沙門(mén)氏菌的鑒定結(jié)果顯示葡萄糖、麥芽糖、鼠李糖、山梨醇、甘露醇、甲基紅、賴氨酸脫羧酶肉湯、硫化氫、西蒙氏枸櫞酸鹽試驗(yàn)中呈陽(yáng)性，在3%氯化鈉三糖鐵試驗(yàn)中產(chǎn)氣、產(chǎn)H2S，在乳糖、蔗糖、蛋白胨水、ONPG、V-P、尿素酶試驗(yàn)中呈陰性。見(jiàn)表1。

表1 病原菌的生化鑒定試驗(yàn)結(jié)果

3.3 藥敏試驗(yàn)的結(jié)果

大腸桿菌的耐藥、中度敏感、高度敏感藥物數(shù)量分別是7 種、2 種、6 種，沙門(mén)氏菌的耐藥、中度敏感、高度敏感藥物數(shù)量分別是5 種、3 種、7種，見(jiàn)表2。

表2 病原菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

4 治療建議

根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，可以選用中度敏感的硫酸鏈霉素，按體重1 mg·kg-1肌肉注射，也可口服用藥，劑量為0.5～1 g，1次·d-1，連續(xù)用藥3 d。最好選用高度敏感的阿米卡星，肌肉一次性注射15 mg，也可在每100 kg 飲水中加入67 g，自由飲用，連續(xù)用藥3 d。同時(shí)，為防止蛋雞因腹瀉出現(xiàn)嚴(yán)重脫水，需要保障飲水充足、干凈，同時(shí)為提高蛋雞群的免疫力，可在蛋雞飲水中添加適量的黃芪多糖，可在每100 kg飲水中加入20 g黃芪多糖粉劑，連續(xù)飲用1周。

5 防控措施

5.1 環(huán)境控制

5.1.1 人和車消毒

雞場(chǎng)大門(mén)口設(shè)立足夠長(zhǎng)、寬的消毒池，消毒試劑可選用2%氫氧化鈉溶液，上方設(shè)立頂棚和噴淋裝置，對(duì)入場(chǎng)車輛進(jìn)行消毒登記。駕駛員未消毒前不能隨意下車，需要佩戴一次性鞋套后進(jìn)入人員消毒室進(jìn)行消毒，人員消毒方法為腳踩3%氫氧化鈉消毒池，經(jīng)過(guò)紫外線消毒通道，手部用0.1%新潔爾滅清洗。

5.1.2 種蛋和蛋雞消毒

種蛋可通過(guò)熏蒸法進(jìn)行消毒，即種蛋入孵前進(jìn)行消毒，每立方米用清水7 mL+40%甲醛溶液14 mL+高錳酸鉀7 g，混勻后熏蒸，時(shí)長(zhǎng)控制在20 min[7]。孵化設(shè)備在熏蒸消毒時(shí)需要關(guān)閉機(jī)門(mén)和通氣孔道，在熏蒸結(jié)束后需要將設(shè)備內(nèi)的殘余氣體排凈后再使用。

種雞可通過(guò)噴霧法進(jìn)行消毒，為減少消毒試劑的毒性和藥物殘留，可以使用小型背包式噴霧器在雞群頭部上方60 cm處進(jìn)行噴霧，消毒試劑為0.015%的百毒殺溶液。

5.1.3 雞舍消毒

每周對(duì)雞舍環(huán)境進(jìn)行消毒，消毒前全面清掃，徹底去除雞群糞便和殘余、變質(zhì)飼料，雞舍消毒試劑可選用0.1%新潔爾滅或0.3%過(guò)氧乙酸溶液[8]，消毒后用清水全面沖洗，保持地面干燥，這樣可以減少病原菌滋生。雞舍飲水管線最好間隔3 d 清洗、消毒1 次，每周消毒時(shí)可以加入0.1%有機(jī)酸，這樣可提高飲水管線內(nèi)部清潔度。

5.2 定期檢測(cè)

規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)要加強(qiáng)種雞的管理，定期進(jìn)行病原菌的血清學(xué)檢測(cè)[9]，并根據(jù)發(fā)病情況制定隔離、淘汰制度，降低病原菌擴(kuò)散，逐步建立凈化雞群。

5.3 科學(xué)引種

蛋雞引種前進(jìn)行大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等病原菌的流行病學(xué)調(diào)查，保證所引種的雞群來(lái)自非疫區(qū)[10]。同時(shí)，引種后要對(duì)每批引種雞只進(jìn)行血清抽樣檢測(cè)，若發(fā)現(xiàn)有病原陽(yáng)性結(jié)果，需要整群隔離處理。

6 體 會(huì)

蛋雞日常生產(chǎn)中的用藥預(yù)防對(duì)病原菌防治具有積極作用，但是長(zhǎng)期以來(lái)抗生素防治不僅會(huì)產(chǎn)生耐藥性問(wèn)題，還會(huì)影響蛋雞自身健康及蛋品質(zhì)。同時(shí)蛋雞生產(chǎn)中禁止使用呋喃類、磺胺類、金霉素、丙酸睪酮、氨茶堿五種藥物，這些藥物不僅會(huì)影響蛋雞產(chǎn)蛋性能，還會(huì)使蛋雞產(chǎn)軟殼蛋，并損害蛋雞健康。因此，蛋雞生產(chǎn)中需要通過(guò)強(qiáng)化日常管理、提高飼養(yǎng)飼喂水平來(lái)增強(qiáng)雞群的免疫力，而非依賴藥物。

另一方面，養(yǎng)殖戶需要根據(jù)蛋雞沙門(mén)氏菌、大腸桿菌的傳播途徑做好預(yù)防管理，定期做好雞場(chǎng)的人、車、種蛋及孵化設(shè)備、蛋雞消毒處理，通過(guò)定期檢測(cè)和科學(xué)引種等操作來(lái)降低病原菌感染率，保障蛋雞健康生長(zhǎng)和生產(chǎn)。