哈爾濱市道里區(qū)蔬菜基地生菜和水土環(huán)境中常見(jiàn)細(xì)菌污染調(diào)查分析

黃翠 單宏 李莉莉 梁溪桐 蘭靜 張瑞英

摘 要：目的：了解哈爾濱市生菜和生菜生長(zhǎng)水土環(huán)境中常見(jiàn)細(xì)菌的污染情況，為調(diào)查和預(yù)防生菜中潛在的風(fēng)險(xiǎn)因子提供參考。方法：采集2019—2021年哈爾濱市周邊3個(gè)生菜種植基地生菜樣品200份，水土環(huán)境樣品70份，參照相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)大腸菌群、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行檢測(cè)。用SPSS軟件進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果：生菜及環(huán)境樣品中，沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌均未檢出，土壤中大腸菌群與蠟樣芽孢桿菌檢出率均高于生菜（p<0.05），紫葉生菜中蠟樣芽孢桿菌檢出率高于綠葉生菜（p<0.05）；綠葉生菜中大腸菌群檢出率2020年高于2019年和2021年（p<0.05），蠟樣芽孢桿菌檢出率2020年高于2021年（p<0.05）和2019年（p<0.05）。結(jié)論：生菜和水土環(huán)境中分別檢出了大腸菌群和蠟樣芽孢桿菌，生食生菜具有一定的安全隱患，相應(yīng)的細(xì)菌污染來(lái)源值得關(guān)注，建議從生菜生產(chǎn)源頭加強(qiáng)產(chǎn)地安全監(jiān)管，保障生菜質(zhì)量安全。

關(guān)鍵詞：生菜；大腸菌群；沙門(mén)氏菌；金黃色葡萄球菌；蠟樣芽孢桿菌

Analysis on the Contamination of Four Common Bacteria in the Lettuce and Environmental Water and Soil in Daoli District in Harbin City

HUANG Cui1，2，3， SHAN Hong1，2，3*， LI Lili1，2，3， LIANG Xitong1，2，3， LAN Jing1，2，3， ZHANG Ruiying1，2，3

（1.Institute of Quality and Safety of Agricultural Products， Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences， Harbin 150086， China; 2.Inspection and Testing Center for Quality of Cereals and Their Products， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Harbin 150086， China; 3.Agricultural Products Quality and Safety Risk Assessment Laboratory， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Harbin 150086， China）

Abstract： Objective： To understand the common bacterial contamination in lettuce and enviromental water and soil samples in Harbin， and to provide reference for the investigation and prevention of potential risk factors in lettuce. Method： 200 lettuce and 70 environmental soil and water samples were collected from three lettuce planting bases in Harbin from 2019 to 2021. Coliform， Salmonella， Staphylococcus aureus and Bacillus cereus were tested with reference to relevant national standards. SPSS 16.0 software was used to make statistical analysis of the detection rate. Result： Salmonella and Staphylococcus aureus were not detected in lettuce and environmental samples. The positive rate of coliform and Bacillus cereus in soil samples was higher than that in lettuce （p<0.05）， and that in purple leaf lettuce was higher than that in green leaf lettuce （p<0.05）. The detection rate of coliform in green lettuce in 2020 was higher than that in 2019 and 2021 （p<0.05）; the detection rate of Bacillus cereus in 2020 was higher than that in 2021 （p<0.05） and 2019 （p<0.05）. Conclusion： Raw lettuce has a certain potential safety hazard， it is suggested to strengthen the safety supervision from the source of lettuce production to ensure the quality and safety of lettuce.

Keywords： Lettuce; coliform; Salmonella; Staphylococcus aureus; Bacillus cereus

隨著社會(huì)的發(fā)展，人們生活水平的提高，人們對(duì)健康愈發(fā)重視，開(kāi)始注重葷素搭配、營(yíng)養(yǎng)均衡，喜食時(shí)令蔬菜。生菜作為即食蔬菜的一種，深受北方人們的喜愛(ài)，食用量很大[1]。但因其簡(jiǎn)單清洗即可入口，本身可能存在食源性致病菌也引起了人們的擔(dān)憂[2]。受近年來(lái)食源性致病菌食品安全問(wèn)題的影響[3]，為保障人們的身體健康，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部指導(dǎo)多地開(kāi)展了即食果蔬中致病菌風(fēng)險(xiǎn)因子調(diào)查評(píng)估[4-5]。本文對(duì)2019—2021年哈爾濱市3個(gè)蔬菜種植基地種植的生菜及生長(zhǎng)水土環(huán)境中常見(jiàn)細(xì)菌進(jìn)行了調(diào)查分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

2019—2021年，分別采集哈爾濱市3個(gè)蔬菜基地7—8月份的大棚栽培綠葉生菜、紫葉生菜及水土環(huán)境樣品，采樣過(guò)程中佩戴無(wú)菌手套并將樣本置于無(wú)菌袋內(nèi)，立即送往實(shí)驗(yàn)室，當(dāng)日進(jìn)行檢測(cè)，3年樣本采集情況如表1所示。

1.1.2 儀器與試劑

（1）儀器。ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、拍擊式均質(zhì)器等。

（2）試劑。北京聚和美M5 GoldStar TaqMan Mixture聚合酶；北京陸橋生理鹽水、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）、煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）、緩沖蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸鈉煌綠增菌液（TTB）、亞硫酸鉍瓊脂（BS）、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂（XLD）、7.5%氯化鈉肉湯、Baird-Parker瓊脂、甘露醇卵黃多黏菌素（MYP）、50%卵黃液、P-36E多黏菌素B、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、0.1%Chelex；所有試劑均在有效期內(nèi)。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)菌株

大腸埃希氏菌ATCC25922、沙門(mén)氏菌ATCC14028、金黃色葡萄球菌ATCC6538、蠟樣芽孢桿菌ATCC11778，均購(gòu)自北京中原公司。

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)方法

（1）細(xì)菌的檢測(cè)。生菜及環(huán)境樣品中大腸菌群、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌及蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn)依次參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》（GB 4789.3—2016）、《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)》（GB 4789.4—2016）、《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》（GB 4789.10—2016）和《蠟樣芽胞桿菌檢驗(yàn)》（GB 4789.14—2014）進(jìn)行測(cè)定。澳大利亞等國(guó)對(duì)即食食品中微生物限量要求是大腸菌群數(shù)量小于104 CFU·g-1，為可接受水平[6]；我國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《蠟樣芽胞桿菌食物中毒診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則》（WS/T 82—1996）對(duì)蠟樣芽孢桿菌數(shù)量的要求為大于105 CFU·g-1的食品會(huì)引起食物中毒[7]。

（2）DNA提取及PCR反應(yīng)。挑取營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上的菌落，加20 μL 0.1% Chelex，沸水浴5 min后，12 000 r·min-1離心5 min，取上清以備PCR反應(yīng)。參照《出口食品中食源性致病菌檢測(cè)方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法》（SN/T 1870—2016）和《出口食品中蠟樣芽孢桿菌快速檢測(cè)方法-實(shí)時(shí)熒光定量PCR法》（SN/T 3932—2014）中引物序列，反應(yīng)體系及反應(yīng)程序。

1.2.2 統(tǒng)計(jì)方法

用SPSS 16.0軟件對(duì)兩個(gè)檢出率差異性做χ2檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05。對(duì)于樣本量小于40的樣本做Fisher精確檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 哈爾濱市道里區(qū)蔬菜生產(chǎn)基地生菜和水土環(huán)境中細(xì)菌檢出情況

如表2、表3所示，2019—2021年共采集哈爾濱市3個(gè)蔬菜生產(chǎn)基地生菜和環(huán)境樣品270份。其中，沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌均未檢出。生菜中大腸菌群檢出率為60.00%（120/200），蠟樣芽孢桿菌檢出率為59.00%（118/200），紫葉生菜蠟樣芽孢桿菌檢出率高于綠葉生菜（90.24%＞50.94%，χ2=20.812，p<0.05）。土壤中的大腸菌群與蠟樣芽孢桿菌檢出率高于生菜中（大腸菌群：94.29%＞60.00%，χ2=15.413，p<0.05；蠟樣芽胞桿菌為100.00%＞59.00%，χ2=22.041，p<0.05）。

不同年份綠葉生菜中大腸菌群檢出率為2020年高于2019年（χ2=28.719，p<0.05）、2021年（χ2=14.783，p<0.05），2020年蠟樣芽孢桿菌檢出率高于2021年（χ2=9.752，p<0.05）和2019年（χ2=25.297，p<0.05），差異均為顯著。紫葉生菜中大腸菌群和蠟樣芽孢桿菌檢出率隨年份不同沒(méi)有顯著差異。

2.2 哈爾濱市道里區(qū)蔬菜生產(chǎn)基地生菜和水土環(huán)境中大腸菌群和蠟樣芽孢桿菌污染濃度情況生菜及環(huán)境樣品中大腸菌群檢出濃度如表4所示。生菜中大腸菌群檢出濃度多集中在1 000～9 999 CFU·g-1，環(huán)境水中多集中在10～99 CFU·g-1，土中多集中在100～999 CFU·g-1，均未超過(guò)104 CFU·g-1。

生菜及環(huán)境樣品中蠟樣芽孢桿菌檢出濃度如表5所示。綠葉生菜蠟樣芽孢桿菌檢出范圍多在100～999 CFU·g-1，紫葉生菜多集中在1 000～9 999 CFU·g-1，環(huán)境水中多集中在10～99 CFU·g-1，土中則集中在10 000～99 999 CFU·g-1，均未超過(guò)105 CFU·g-1。

3 討論

本文對(duì)2019—2021年哈爾濱市蔬菜生產(chǎn)基地中生菜及水土環(huán)境樣品中大腸菌群、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌污染情況進(jìn)行了調(diào)查，大腸菌群作為糞便污染的衛(wèi)生指標(biāo)菌，反映了生菜樣品的衛(wèi)生情況。參照澳大利亞等國(guó)對(duì)即食食品中微生物限量要求，大腸菌群數(shù)量小于104 CFU·g-1，為可接受范圍，當(dāng)大腸菌群數(shù)量大于104 CFU·g-1時(shí)，為不合格產(chǎn)品[6]。本次對(duì)哈爾濱市基地生菜的調(diào)查，大腸菌群的檢出率為60.00%，檢出濃度均未超過(guò)不合格濃度。沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌是兩種常見(jiàn)的致病菌，本次調(diào)查中均未檢出。在以往的研究中鮮有沙門(mén)氏菌在生菜中檢出的報(bào)道，而金黃色葡萄球菌在河南省[4]、浙江省[8]的生菜樣品中均有檢出的報(bào)道。本次金黃色葡萄球菌在生菜和種植環(huán)境樣本的調(diào)查中均未檢出，這可能與地域、氣候、環(huán)境或種植方式不同有關(guān)[9]。蠟樣芽孢桿菌為條件致病菌，當(dāng)蠟樣芽孢桿菌濃度到達(dá)105 CFU·g-1時(shí)，可能引起食物中毒[7]，此次對(duì)哈爾濱市基地生菜的調(diào)查，蠟樣芽孢桿菌檢出率為59.00%，但檢出濃度均未超過(guò)105 CFU·g-1。總體而言，雖然本次調(diào)查大腸菌群和蠟樣芽孢桿菌檢出比率較高，但檢出濃度并未超過(guò)風(fēng)險(xiǎn)濃度，但考慮到微生物隨溫度有一定的消長(zhǎng)，紫葉生菜蠟樣菌定量分析，考慮其即食性，仍存在一定的食品安全隱患。

就不同年份來(lái)說(shuō)，哈爾濱市基地綠葉生菜中大腸菌群檢出率2020年高于2019年和2021年，蠟樣芽孢桿菌檢出率2020年高于2021年和2019年，這可能與不同年份氣候條件變化有關(guān)[10]。就不同生菜類型講，紫葉生菜中蠟樣芽孢桿菌污染風(fēng)險(xiǎn)較綠葉生菜高，這可能與葉片中色素種類及含量不同或葉片的表面質(zhì)地不同對(duì)致病菌吸附能力不同有關(guān)[11]。對(duì)于種植環(huán)境水的調(diào)查，本文采集了剛抽取上來(lái)的地下水（哈爾濱蔬菜基地多以抽取地下水灌溉為主）、地表的殘水和水缸中殘留的雨水，發(fā)現(xiàn)大腸菌群與蠟樣芽孢桿菌檢出的樣品多為地表的殘水和水缸中殘留的雨水，而地下水基本未檢出，說(shuō)明剛抽取上來(lái)的地下水相對(duì)較好。對(duì)于土壤的調(diào)查，本文采集了種植土，其大腸菌群與蠟樣芽孢桿菌檢出率與檢出濃度均較高，土壤中大腸菌群可能與農(nóng)家肥的施用有關(guān)，而土壤中含有較多的蠟樣芽孢桿菌芽孢[12]，并且土壤中蠟樣芽孢桿菌檢出率高于生菜，推測(cè)生菜中蠟樣芽孢桿菌污染可能來(lái)自土壤，這一觀點(diǎn)與劉一倩等[13]的研究相同。

目前，國(guó)內(nèi)外尚未有初級(jí)農(nóng)產(chǎn)品中衛(wèi)生指標(biāo)菌與致病菌限量標(biāo)準(zhǔn)。已經(jīng)實(shí)施的《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 預(yù)包裝食品中致病菌限量》（GB 29921—2021）[14]中僅規(guī)定了即食果蔬制品中致病菌限量，即將實(shí)施的《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 散裝即食食品中致病菌限量》（GB 31607—2021）[15]中有蠟樣菌限量規(guī)定，雖僅限米制品，也可借鑒參考。廣東省2016年頒布了食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)《非預(yù)包裝即食食品微生物限量》（DBS 44/006—2016），標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定去皮或預(yù)切的果蔬或果蔬食品中，沙門(mén)氏菌不得檢出，大腸埃希氏菌超過(guò)102 CFU·g-1，金黃色葡萄球菌超過(guò)104 CFU·g-1，蠟樣芽孢桿菌超過(guò)105 CFU·g-1，為不合格樣品[16]。我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品中食源性致病菌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作起步較晚，基礎(chǔ)數(shù)據(jù)不充分，農(nóng)產(chǎn)品中風(fēng)險(xiǎn)因子不清，來(lái)源不明，鑒于近年來(lái)國(guó)際上由致病菌引發(fā)的食品安全事件時(shí)有發(fā)生[17-18]，而國(guó)際間往來(lái)頻繁，國(guó)際貿(mào)易持續(xù)增長(zhǎng)，存在食源性致病菌傳入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)，因此建議加大對(duì)我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品，尤其是即食果蔬中致病菌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的力度，充實(shí)數(shù)據(jù)，保證農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全，確保我國(guó)出口果蔬的產(chǎn)品質(zhì)量，提升我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品在國(guó)際市場(chǎng)上的地位[19]。同時(shí)，加快推進(jìn)實(shí)施良好農(nóng)業(yè)操作規(guī)范、良好生產(chǎn)規(guī)范和良好衛(wèi)生規(guī)范在內(nèi)的管理體系，完善生產(chǎn)、運(yùn)輸和銷售產(chǎn)業(yè)鏈管理體系也能有效減少病原微生物的污染和傳播[20-21]。

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