飲料中腐敗酵母菌的分離、鑒定及控制研究

周婀 馬瑜

摘 要：目的：研究飲料變敗原因及生產(chǎn)中常用防腐劑對(duì)其控制效果，為飲料腐敗菌的控制及防腐劑的選擇、添加提供理論參考數(shù)據(jù)。方法：以脹瓶的飲料為研究對(duì)象，對(duì)分離、純化所得典型菌落進(jìn)行菌落形態(tài)及細(xì)胞特征觀察，并采用通用引物NL1/NL4擴(kuò)增菌株26S rRNA序列進(jìn)行同源性分析，將其作為供試菌，研究生產(chǎn)中常用防腐劑對(duì)其控制效果。結(jié)果：從樣本中分離獲得一株乳白色酵母菌KS01，通過其形態(tài)特征及26S rDNA序列的同源性分析，確定該菌株為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）；低劑量山梨酸鉀和苯甲酸鈉均對(duì)異常威克漢姆酵母具有顯著且持續(xù)的抑制效果（P＜0.01）。結(jié)論：微生物的生長是導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)的根本原因，不同微生物的致腐能力和特征不同。在新型飲料產(chǎn)品（如具有酸性、富氧、含糖等特征的飲料）的研發(fā)工作中需謹(jǐn)防因異常威克漢姆酵母污染導(dǎo)致的產(chǎn)品腐敗變質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)食品生產(chǎn)安全高效、低成本。

關(guān)鍵詞：腐敗酵母菌；分離鑒定；異常威克漢姆酵母；山梨酸鉀；苯甲酸鈉

Isolation， Identification and Control of Spoilage Yeast in Beverage

ZHOU E1， MA Yu2*

（1.Master Kong Co.，? Ltd.， Beverage IRD Center， Shanghai 201101， China;

2.Microbiology Institute of Shaanxi， Xian 710043， China）

Abstract： Objective： Study the causes of beverage deterioration and the control effect of common preservatives used in production， then， provide theoretical reference data for the control of beverage spoilage microorganisms and the selection and addition of preservatives. Method： The spoilage yeast in beverage was isolated， purified and identified from the swelling packages via gradient dilution method. The morphology and cell characteristics of typical colonies were observed. The 26S rRNA sequence was amplified with primer NL1/NL4 and sequenced. The homology analysis was then performed. Then， the antibacterial effects of common preservatives on the strain were then investigated. Result： A milky yeast KS01 was isolated from the spoilage beverage. Morphological characteristics and 26S rDNA sequence analysis proved that KS01 was identified to be Wickerhamomyces anomalus. The follow studies showed that both assium sorbate and sodium benzoate exhibited remarkable and sustainable inhibition effect on W. anomalus （P＜0.01）. Conclusion： The growth of microorganisms is the root cause of food spoilage. Different microorganisms have different abilities and characteristics of causing food spoilage. In the research and development of new beverage products （such as those with acidic， oxygen rich， sugar and other characteristics）， it is necessary to guard against product corruption caused by abnormal Wickham yeast pollution， so as to achieve safe， efficient and low-cost food production.

Keywords： spoilage yeast; isolation and identification; Wickerhamomyces anomalus; potassium sorbate; sodium benzoate

酵母菌（Yeasts）是一類單細(xì)胞真核微生物，以芽殖或裂殖方式進(jìn)行無性繁殖，也可通過形成子囊孢子進(jìn)行有性繁殖[1]。酵母菌對(duì)環(huán)境的耐受性較強(qiáng)，可在低溫、低濕、低pH值、高鹽度及高糖度等多數(shù)細(xì)菌無法生長的環(huán)境中生存，因此其廣泛分布于各生態(tài)位，與人類生活息息相關(guān)。食品的特性和加工貯藏的條件可抑制細(xì)菌的快速生長和競(jìng)爭(zhēng)力，同時(shí)軟飲料自身較低的pH值（通常在2.6～4.0）可抑制大多數(shù)細(xì)菌及病原菌的生長。因此，在高酸性和/或高糖度條件下，酵母菌是食品及工業(yè)飲料中普遍存在的腐敗微生物源。雖然腐敗酵母菌在已知酵母類群中僅占很小的比例，但其會(huì)引起食品感官評(píng)價(jià)降低，進(jìn)而引起食品腐敗等一系列安全問題[2-3]。食品的腐敗變質(zhì)會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，在新型產(chǎn)品研發(fā)和生產(chǎn)中防止腐敗是食品科學(xué)工作者最關(guān)注的一個(gè)問題[4-6]。

微生物的生長是導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)的根本原因，腐敗酵母菌的生長不僅可改變飲料風(fēng)味，產(chǎn)生渾濁、沉淀物或絮凝物等腐敗變質(zhì)現(xiàn)象，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致包裝膨脹甚至爆炸[7-8]。食品防腐劑作為食品添加劑的一個(gè)類別，可通過干擾微生物的遺傳物質(zhì)及功能蛋白的正常運(yùn)作抑制微生物的生長，從而達(dá)到延長食品保鮮期和保質(zhì)期的目的[9]。食品防腐劑的應(yīng)用已成為食品產(chǎn)業(yè)鏈的常態(tài)，與人們的日常生活密不可分。在食品中添加合適的防腐劑既可以保證食品的風(fēng)味又能保證食品安全。不同微生物的致腐能力和特征不同，為研究飲料腐敗變質(zhì)的原因，本研究對(duì)出現(xiàn)脹瓶的飲料中的腐敗酵母菌進(jìn)行了分離、純化、鑒定，確定腐敗菌的微生物種類，并以其為供試菌，研究了生產(chǎn)中常用防腐劑對(duì)其控制效果，以期為飲料腐敗菌的控制及防腐劑的選擇、添加提供理論參考數(shù)據(jù)，從而有效解決其在貯藏過程中因微生物變敗脹罐問題，實(shí)現(xiàn)食品生產(chǎn)安全高效、低成本。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山梨酸鉀、苯甲酸鈉（食品級(jí)），上海阿拉丁試劑有限公司；孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；核酸提取試劑及PCR試劑，Takara Bio公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；生化培養(yǎng)箱，天津泰斯特儀器有限公司；數(shù)顯干燥箱，天津泰斯特儀器有限公司；電子天平，賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；移液器，德國Eppendorf；PCR儀，美國ABI；DYY-6C型電泳儀，北京六一儀器廠；全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株分離與純化

采用梯度稀釋法用無菌生理鹽水對(duì)脹瓶樣品進(jìn)行10倍遞增系列梯度稀釋，各稀釋度分別取1 mL樣品勻液于2個(gè)無菌平皿內(nèi)，加入25 mL 45 ℃孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基，混合均勻。同時(shí)，分別取1 mL無菌稀釋液勻液于2個(gè)無菌平皿內(nèi)作為空白對(duì)照。待培養(yǎng)基完全凝固后置于28 ℃培養(yǎng)2～5 d。取典型菌落編號(hào)為KS01并在分離培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線純化。

1.3.2 菌種鑒定

形態(tài)特征及理化實(shí)驗(yàn)鑒定參考《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》進(jìn)行鑒定[10]。同時(shí)，采用通用引物NL1-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG和NL4-GGTCCGTGTTTCAAGACGG，擴(kuò)增26S rRNA序列。PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃

1 min，退火52 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 80 s，共35個(gè)循環(huán)；再延伸72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送至北京華大基因科技有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.3.3 不同防腐劑對(duì)酵母菌的控制研究

參考《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）[11]中規(guī)定的添加量，分別配制含0 g·kg-1、0.05 g·kg-1、0.10 g·kg-1和0.15 g·kg-1（4個(gè)濃度組）苯甲酸鈉及山梨酸鉀的樣品；同時(shí)，用生理鹽水將活化后的酵母菌菌株進(jìn)行梯度稀釋，制得菌懸液備用。無菌條件下，在含有不同濃度的苯甲酸鈉和山梨酸鉀的樣品中加入酵母菌菌懸液，使酵母菌的初始濃度為1.5×103 CFU·mL-1。每組樣品3個(gè)平行，混勻后于28 ℃靜置，在第0天、第3天、第7天和第28天分別進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。以生理鹽水為空白對(duì)照。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

應(yīng)用BLAST程序?qū)λ@得的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性比較，并利用Clustal X及MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；應(yīng)用Graph Pad 5.0進(jìn)行進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及正交實(shí)驗(yàn)方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的分離結(jié)果及形態(tài)特征

如圖1A所示，KS01菌落在PDA培養(yǎng)基上呈乳白色，周圍光滑，圓形，中央微隆起，邊緣整齊，有明顯光澤。菌落直徑3～4 mm，黏稠，易于挑取，有芳香味。如圖1B所示，其細(xì)胞呈卵圓形，大小為（3.0～7.5） μm×（1.5～3.0） μm（長×寬）。

2.2 酵母菌的鑒定結(jié)果

菌株KS01經(jīng)NL1/NL4引物擴(kuò)增所得26S rDNA序列長度大小為587 bp。利用BLAST軟件將該序列在NCBI中已有的序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株KS01與多株異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）的26S rDNA序列的同源性均在100%。利用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育圖（圖2），明確KS01與相關(guān)酵母菌之間的親緣關(guān)系。結(jié)合形態(tài)鑒定結(jié)果和同源性比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果，可認(rèn)定菌株KS01為異常威克漢姆酵母（W. anomalus）。

2.3 常見防腐劑對(duì)酵母菌的控制研究

2.3.1 苯甲酸鈉對(duì)酵母菌的控制研究

不同濃度的苯甲酸鈉對(duì)異常威克漢姆酵母菌KS01的控制效果如圖3所示。苯甲酸鈉對(duì)KS01的抑制效果與處理濃度及時(shí)間呈正相關(guān)，相同處理時(shí)間點(diǎn)，樣品中酵母菌菌體量隨苯甲酸鈉濃度的增加而呈逐漸下降趨勢(shì)；含相同濃度苯甲酸鈉的樣本中酵母菌菌體量隨處理時(shí)間的延長呈現(xiàn)逐降低的趨勢(shì)。因此，不同處理濃度的苯甲酸鈉從處理第3天開始均對(duì)異常威克漢姆酵母具有顯著且持續(xù)的抑制效果（P＜0.001）。

2.3.2 山梨酸鉀對(duì)酵母菌的控制研究

不同濃度的山梨酸鉀對(duì)異常威克漢姆酵母菌KS01的控制效果如圖4所示。山梨酸鉀對(duì)異常威克漢姆酵母控制效果極顯著（P＜0.01），其對(duì)異常威克漢姆酵母控制效果與處理濃度及時(shí)間呈正相關(guān)。處理3 d后，0.05 g·L-1山梨酸鉀對(duì)KS01的控制效果極顯著（P＜0.01），且隨山梨酸鉀濃度的增加，控制效果逐漸增強(qiáng)（P＜0.001）。同一處理時(shí)間，樣品中酵母菌菌體量隨山梨酸鉀濃度的增加而呈下降趨勢(shì)；同一處理濃度中，隨著處理時(shí)間的延長，樣品中酵母菌菌體含量呈降低的趨勢(shì)，靜置28 d后，菌體含量不足20 CFU·mL-1，說明苯甲酸鈉對(duì)異常威克漢姆酵母具有顯著、持續(xù)的抑制效果。本研究中采用的兩種防腐劑相比，山梨酸鉀更安全，可保持食品原有的產(chǎn)品穩(wěn)定性，可作為抑制異常威克漢姆酵母污染的首選防腐劑。

3 討論

食品加工、貯運(yùn)過程中由微生物引起的腐敗變質(zhì)一直是食品保鮮領(lǐng)域面臨的世界性難題[12]。防腐劑可通過有效抑制食品中微生物的生長、繁殖，提升食品保存性，最終達(dá)到延長保存期和貨架期的目的[13]。但隨著食品工業(yè)的快速發(fā)展，傳統(tǒng)的食品防腐劑已無法滿足生產(chǎn)需求，因此選擇有效、操作簡便、低成本的防腐劑成為食品生產(chǎn)企業(yè)急需解決的關(guān)鍵問題。異常威克漢姆酵母（W. anomalus）屬畢赤酵母，是食品生產(chǎn)各環(huán)節(jié)中普遍存在的酵母菌，也是飲料生產(chǎn)中常見的一種引起腐敗的酵母菌[14-16]。郭冬琴等[6]從滅菌后脹瓶的橙汁中分離得到W. anomalus，與本研究所得結(jié)果一致。陸文俊等[17]也從蜂蜜中分離得到2株異常威克漢姆酵母，是蜂蜜中主要的腐敗酵母菌，且具有較強(qiáng)的腐敗能力。也有研究表明，畢赤酵母屬也是導(dǎo)致葡萄酒和米酒發(fā)酵異常的原因之一[18-19]。因此，微生物的生長是導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)的根本原因，且不同微生物的致腐能力和特征不同。根據(jù)酵母菌的發(fā)生率和變質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)，可將食品飲料生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)的酵母菌劃分為3個(gè)類別，異常威克漢姆酵母屬于軟飲料工廠生產(chǎn)中常見的第2類腐敗酵母菌[20-21]。

防腐劑是食品生產(chǎn)過程中必不可少的添加劑。目前，我國使用的防腐劑主要是化學(xué)類食品防腐劑，其中酸性防腐劑如苯甲酸、山梨酸對(duì)酵母菌、霉菌及多數(shù)腐敗菌均有抑制效果。已有的研究表明，苯甲酸鈉主要通過干擾細(xì)胞代謝相關(guān)的酶活性抑制微生物細(xì)胞三羧酸循環(huán)，影響細(xì)胞代謝，阻礙細(xì)胞膜的通透性；而山梨酸鉀主要通過與巰基結(jié)合干擾細(xì)胞內(nèi)多種酶系統(tǒng)，從而達(dá)到抑制微生物生長的目的[4]。二者都屬于酸性防腐劑，在酸性環(huán)境下對(duì)微生物的抑制效果顯著，這與本研究中產(chǎn)品性質(zhì)一致，因此苯甲酸鈉和山梨酸鉀對(duì)異常威克漢姆酵母具有明顯持續(xù)的抑制效果。苯甲酸鈉和山梨酸鉀屬于酸性防腐劑，其抑菌效果主要取決于它們未解離的酸分子，抑菌效果隨pH而定，酸性越大效果越好，而在堿性環(huán)境中幾乎無效[22]。相同pH值下，苯甲酸的未解離度僅為山梨酸的1/3，其抑菌效力亦僅為山梨酸的1/3，因此山梨酸鉀防腐效果比苯甲酸鈉好[23]。此外，苯甲酸及其鈉鹽有疊加中毒現(xiàn)象，而山梨酸及其鹽類抗菌力強(qiáng)，毒性小，是目前國際上公認(rèn)的最好防腐劑，已被所有國家和地區(qū)允許使用[24]。另有研究表明飲料中富含氧氣可促使異常威克漢姆酵母增殖，最終導(dǎo)致產(chǎn)品腐敗[8，25]。因此，應(yīng)及時(shí)對(duì)生產(chǎn)設(shè)備和產(chǎn)品進(jìn)行酵母菌監(jiān)測(cè)，從全方位確保產(chǎn)品質(zhì)量。為不斷提升產(chǎn)品的品質(zhì)和安全性，天然防腐劑的選擇和復(fù)配研究工作將是后續(xù)研究工作的重點(diǎn)。

4 結(jié)論

從腐敗飲料樣本中分離獲得一株乳白色酵母菌，將其命名為KS01。根據(jù)其菌落形態(tài)、細(xì)胞特征及26S rDNA序列分析結(jié)果，認(rèn)定菌株KS01為異常威克漢姆酵母（W. anomalus）。因此，在新型飲料產(chǎn)品（如具有酸性、富氧、含糖等特征的飲料）的研發(fā)工作中需謹(jǐn)防因異常威克漢姆酵母污染導(dǎo)致的產(chǎn)品腐敗變質(zhì)。同時(shí)，污染酵母菌的控制研究結(jié)果表明，低劑量山梨酸鉀和苯甲酸鈉均對(duì)異常威克漢姆酵母具有顯著且持續(xù)的抑制效果（P＜0.01）。其中，山梨酸鉀在保持食品原有的產(chǎn)品穩(wěn)定性的同時(shí)更安全，可作為抑制異常威克漢姆酵母污染的首選防腐劑，符合食品防腐劑應(yīng)具有的低濃度下防腐效果好、性質(zhì)穩(wěn)定、成本低廉等特點(diǎn)，為防腐劑的選擇和添加提供參考。

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