菌株HMQ20YJ11的篩選鑒定及對辣椒疫病的抑制評價

摘要：辣椒疫病是困擾世界辣椒產業的一個嚴重而持久的問題，難以通過化學和農業手段加以控制。為篩選出具有防控疫病應用潛力的本地可培養有益細菌，從民勤鹽堿化土壤中分離到42株生防細菌，采用對峙培養法進行篩選。 結果表明，菌株HMQ20YJ11對9種植物病原菌具有較強的拮抗活性。通過16S rRNA基因、gyrA基因和gyrB基因序列分析鑒定，菌株HMQ20YJ11為萎縮芽孢桿菌。 菌株HMQ20YJ11能夠產生α-淀粉酶、氨、纖維素酶、吲哚-3-乙酸、果膠酶、蛋白酶、鐵載體和溶解磷酸鹽。在溫室條件下，與未處理對照相比，菌株HMQ20YJ11可顯著降低疫病的嚴重程度。 田間進行測試的結果表明，菌株HMQ20YJ11可顯著降低疫病的嚴重程度，具有防治疫病的潛力。由此可看出，菌株HMQ20YJ11對植物病害具有拮抗作用，可作為潛在的生物防治菌劑加以應用。

關鍵詞：萎縮芽孢桿菌；拮抗活性；篩選；鑒定；辣椒疫病；辣椒疫霉菌

中圖分類號：S436.418.1" " " " " 文獻標志碼：A" " " " " 文章編號：2097-2172（2022）01-0088-06

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2022.01.017

Identification of Bacillus atrophaeus Strain HMQ20YJ11 and Evaluation of Its Inhibitory Activity against Pepper Phytophthora Blight

GUO Zhijie 1， 2， 3， XU Shengjun 1， 2， 3， JING Zhuoqiong 1， 2， 3， SUN Qian 1， 2， 3， SHANG Hongmei 4， SHANG Xiaohua 4， ZHUO Macao 4

（1. Institute of Plant Protection， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China; 2. Scientific Observing and Experimental Station of Crop Pests in Tianshui， the Ministry of Agriculture and Rural Affairs， P. R. China， Gangu Gansu 741200， China; 3. National Agricultural Experimental Station for Plant Protection at Gangu， the Ministry of Agriculture and Rural Affairs， P. R. China， Gangu Gansu 741200， China; 4. Gannan Agricultural Sciences Research Institute， Hezuo Gansu 747000， China）

Abstract： Pepper phytophthora blight is a severe and persistent problem in pepper industry worldwide， which is difficult to control throught chemical and agricultural means. The current study was designed to screen native cultivable rhizobacteria with potential applications for biocontrol of phytophthora blight， atotal of 42 strainswere isolated from salinized soil and screened by dual culture assay. Results revealed that the strain HMQ20YJ11 showed strong antagonistic activity against 9 plant pathogens. Based on 16S rRNA gene， gyrA gene and gyrB gene sequence analysis identified strain HMQ20YJ11 as Bacillus atrophaeus. Strain HMQ20YJ11 demonstrated many characteristics that are beneficial for plants， such as production of α-amylase， ammonia， cellulase， indole-3-acetic acid， pectinase， protease， siderophores， and phosphate solubilization. In planta application of strain HMQ20YJ11 significantly decreased phytophthora blight severity compared to untreated controls under greenhouse conditions. The strain HMQ20YJ11 was tested in the field and demonstrated a dramatic decrease in disease severity， suggesting strain HMQ20YJ11 as potential biocontrol candidate for phytophthora blight. These results suggested thatstrain HMQ20YJ11 could provide protection against plant disease and could be used as a potential agent for biological control.

Key words： Bacillus atrophaeus; Antagonistic activity; Screening; Identification; Pepper phytophthora blight; Phytophthora capsici

辣椒（Capsicum annuum L.）屬一年生或有限多年生草本茄科植物，是一種日益重要的經濟作物，可作為蔬菜、香料和食品著色劑，此外還具備一定的藥用價值［1 - 3 ］。隨著辣椒栽培面積的不斷增加，生產常伴隨著高度的集約化種植，造成復種指數高，給土傳病害的病原提供了賴以生存的寄主和繁殖場所，導致土壤中病原菌的大量積累，土傳病害的發生越來越嚴重，其中由辣椒疫霉菌引起的疫病，已經嚴重制約了辣椒生產的發展。目前，為了避免和控制這種病害，種植者通常很大程度上依賴于化學殺菌劑。然而，由于病原菌在植物維管組織內傳播以及其在土壤中休眠結構的長期存活，化學殺菌劑的效果有限。同時，化學殺菌劑的大量使用導致病原菌產生抗藥性、生態環境污染、生物多樣性破壞，并在食物中積累有害的化學殘留物等一系列食品安全和生態環境問題。為了減少化學農藥的使用，國家農業部于2015年審議通過了《到2020年農藥使用零增長行動方案》，強調了綠色防控病害的作用。生物防治能夠克服化學防治帶來的一系列弊端，能間接產生一定的經濟效益、生態效益和社會效益，符合建設可持續發展的、生態友好的綠色農業系統的發展趨勢。因此，與化學防治相比，生物防治劑是作物管理計劃中環境友好和生物安全的組成部分［4 - 6 ］。

利用具有植物促生長特性的天然拮抗微生物進行生物防治，可以降低病原菌對受影響作物的危害程度，提高作物的產量。這些潛在的天然拮抗微生物由芽孢桿菌等不同屬的微生物組成，以游離生物的形式存在于土壤中，具有促進植物生長的作用，保護作物免受病害危害［7 ］。其中，芽孢桿菌是一類主要的天然拮抗微生物，它可以形成內生孢子，在惡劣的環境條件下可在土壤中長期生存。芽孢桿菌在植物生長和健康方面發揮著至關重要的作用，因為它們可以通過產生植物激素來全面改善植物生長，保護植物免受病原菌和其他非生物脅迫，穩定土壤團聚體，維持土壤養分和結構等［8 - 10 ］。在溫室和露地多應用芽孢桿菌來防控由辣椒疫霉菌引起的疫病［11 - 12 ］，然而，促進一種農作物生長的生防菌劑并不一定對其他農作物有類似的影響［13 ］。一些細菌對幾種農作物產生了普遍的促進生長作用，而其他的細菌則表現出強烈的寄主農作物選擇性，并對單個農作物或有限的農作物進行定殖。此外，生防微生物與土壤生態環境中的微生物群落之間常存在相互作用，外源生防微生物的引入可引起農作物根際土壤微生物群落的組成發生變化，因此生防菌劑的使用有很大的地域適應性。我們的研究旨在從土壤中分離、篩選、鑒定土著的可培養細菌，并評價其對辣椒的促生長和抑病作用，為開發穩定有效的生物防治劑提供潛在菌株。

1" "材料與方法

1.1" "供試材料

1.1.1" " 供試生防細菌及菌株供試" " 生防細菌分別為灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、松針刺盤孢菌（Colletotrichum fioriniae）、尖孢炭疽菌（Colletorichum acutatum）、禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）、尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）、茄病鐮刀菌（F. solani）、輪枝鐮刀菌（F. verticillium）、辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）和核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）。供試生防菌株為萎縮芽孢桿菌HMQ20YJ11。以上生防細菌及菌株均由甘肅省農業科學院植物保護研究所提供。

1.1.2" " 供試藥劑" " 供試化學藥劑為1×1011芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑（由德強生物股份有限公司提供）、50%氟啶胺懸浮劑（由江陰蘇利化學股份有限公司提供）。

1.1.3" " 指示作物" " 指示辣椒品種為長豐辣椒，由湖南湘研種業有限公司選育并提供。

1.1.4" " 防治對象" " 防治對象為辣椒疫病（Pepper Phytophthora blight）。

1.2" "試驗方法

1.2.1" " 細菌的分離和保存" " 土壤樣品采集于甘肅省武威市民勤縣鹽堿化地塊。采樣地塊隨機選取5個點，取0～5 cm鹽堿化土壤，混合后用密封袋帶回，用0.2 cm網眼的篩子除去土塊和植物殘體，室溫風干。采用梯度稀釋制成最終濃度為×10-5的土壤懸浮液［14 ］。選擇×10-3、×10-4、×10-5 3個濃度的懸浮液，各吸取100 μL，加到NaCl含量為100 g/kg的LB培養基平板上，用涂布棒涂布均勻，做3個重復。將培養基平板在28 ℃恒溫下培養5 d，選擇不同形態的菌落轉移到新的NaCl含量為100 g/kg的LB培養基平板上進行純化培養，4 ℃保存待測。菌株用凍存管（甘油含量為20%）置于-80 ℃超低溫冰箱中冷凍長期保存。

1.2.2" " 生防細菌篩選和拮抗能力測定" " 利用平皿對峙培養法篩選和測定生防細菌拮抗灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、松針刺盤孢菌（Colletotrichum fioriniae）、禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）、尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）、茄病鐮刀菌（F. solani）、輪枝鐮刀菌（F. verticillium）、辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）和核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）的能力［11 ］。

1.2.3" " 利用基因序列分析" " 鑒定菌株HMQ20YJ11用Fast TIANamp Bacteria DNA Kit［天根生化科技（北京）有限公司］提取生防細菌HMQ20YJ11的全基因組DNA。使用通用引物組27F和1492R，gyrA-F和gyrA-R，UP1和UP2r分別擴增16S rRNA基因、gyrA基因和gyrB基因。25 μL反應混合物在PCR熱循環儀上進行擴增。PCR產物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。將測序結果在NCBI數據庫中進行比對，從NCBI基因庫數據庫中下載相關物種的16S rRNA、gyrA和gyrB基因序列，利用MEGA 6.0進行系統發育研究。

1.2.4" " 離體防病促生相關活性測定" " 對菌株HMQ20YJ11進行產生纖維素酶和蛋白酶、果膠酶和α-淀粉酶、氨、IAA和鐵載體和磷酸鹽溶解的體外活性測定［14 - 19 ］，這些活性由特定培養基上細菌菌落周圍的顏色變化和明顯的光環表征。

1.2.5" " 菌株HMQ20YJ11菌劑對辣椒疫病的苗盤防控效果" " 測定菌株HMQ20YJ11接種在LB固體培養基上進行活化后，轉接于裝有50 mL LB液體培養基的100 mL的三角瓶中，28 ℃、150 rpm振蕩培養24 h獲得種子液。將種子液按體積比1∶100的比例接種于發酵培養基（1/2PDB + 1/2LB）中，28 ℃、150 rpm振蕩培養24 h。

將長豐辣椒種子在1 g/kg的次氯酸鈉溶液中表面消毒20 min，然后用無菌水清洗4次。種子播種在裝滿園藝土壤的50孔苗盤，每孔播1粒。幼苗在無病蟲、溫度控制在20～30 ℃的溫室里生長56 d后，接種病原菌前3 d將20 mL菌株HMQ20YJ11發酵液（活菌濃度108 CFU/mL）分別澆入植株根部的園藝土壤，防止多余的液體從苗盤底部流出。清水、枯草芽孢桿菌、氟啶胺分別作為空白對照和陽性對照采用與上述相同的處理方法處理植株。每處理重復3次，共30株。用移液管取10 mL P. capsici接種物（1×105孢子囊/mL）澆入每個植株根部的園藝土壤中。將接種后的植物放置在生長室中，保持濕度超過90%，溫度控制在20～30 ℃。在接種病原菌后的第7天調查病情級數，計算防控效果。病情分級標準：0級為健康無癥；1級為幼苗根莖部輕微變黑，葉片不萎蔫或可恢復性萎蔫；2級為幼苗根莖部變黑達1～2 cm，葉片不可恢復性萎蔫，下部葉片偶有脫落；3級為幼苗根莖部變黑超過2 cm，葉片明顯萎蔫或脫落；4級為幼苗根莖部變黑縊縮，除生長點外全部落葉或植株萎蔫；5級為全株枯死。

1.2.6" " 生防細菌對辣椒疫病的盆栽防控效果測定

如1.2.5所述方法處理辣椒種子。將種子播種在裝滿園藝土壤的105孔苗盤里，每孔播1粒種子。幼苗生長在無病蟲的溫度控制在20～30 ℃的溫室里28 d后，移栽到裝滿園藝土壤的塑料盆中（直徑10 cm），繼續在無病蟲、溫度控制在20～30 ℃的溫室里生長28 d。在接種病原菌前3 d和4 h，將50 mL菌株HMQ20YJ11發酵液（活菌濃度108 CFU/mL）分別澆入植株根部的園藝土壤，防止多余的液體從塑料盆底部流出。清水、枯草芽孢桿菌和氟啶胺分別作為空白對照和陽性對照采用與上述相同的方法處理植株。每處理重復3次，共30株。用移液管取10 mL P. capsici接種物（1×105孢子囊/mL）澆入到每個植株根部的園藝土壤中。接種后的植物置于生長室中，保持濕度超過90%，溫度控制為20～30 ℃。在接種病原菌后的第14 天調查病情級數，計算防控效果。病情分級標準同上。

1.2.7" " 生防細菌對辣椒疫病的田間防控效果" " 測定2021年辣椒生長季，在甘肅省農業科學院植物保護研究所蘭州試驗站進行人工接種田間試驗，測定菌株HMQ20YJ11對辣椒疫病的防治效果。如上所述準備菌株HMQ20YJ11發酵液和辣椒幼苗。5月17日，將辣椒幼苗（苗齡63 d）分別移栽到300 m2試驗地，行、株距分別為50 、30 cm。處理設定菌株為HMQ20YJ11、枯草芽孢桿菌、氟啶胺和清水（空白對照），進行隨機區組試驗，每個處理重復3次。8月1日、8日、15日，將100 mL菌株HMQ20YJ11發酵液（活菌濃度108 CFU/mL）、枯草芽孢桿菌和氟啶胺（依照供應商推薦的劑量）和清水分別澆入植株根部。8月15日，將10 mL P. capsici接種物（1×105孢子囊/mL）澆入到每個植株根部周圍土壤中。在接種病原菌后的第15 d調查病情級數，計算防控效果。病情分級標準：0級為健康無癥；1級為地上部僅葉、果有病斑；2級為地上莖、枝有褐腐斑；3級為莖基部有褐腐斑；4級為地上莖、枝與莖基部均有褐腐斑，并且部分枝條枯死；5級為全株枯死。

2" "結果與分析

2.1" "菌株HMQ20YJ11的篩選和拮抗能力

根據宏觀形態特征，從鹽堿化土壤中選擇性分離出42株細菌。通過平板對峙培養法篩選和測定所有細菌菌株對9種植物病原菌菌絲生長的抑制能力（表2）。篩選得到6個最有效的拮抗菌株，其中菌株HMQ20YJ11拮抗能力最強，選擇該菌株進一步研究。菌株HMQ20YJ11對灰葡萄孢菌、松針刺盤孢菌、禾谷鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌、輪枝鐮刀菌、辣椒疫霉菌、立枯絲核菌和核盤菌的抑制率分別為63.72%、48.53%、46.56%、42.07%、57.40%、63.04%、44.52%、54.38%、53.84%，抑菌帶寬分別為7.77、5.88、2.92、5.69、4.69、4.38、6.84、9.49、9.52 mm。

2.2" "菌株HMQ20YJ11鑒定

通過16S rRNA基因、gyrA基因和gyrB基因序列分析，菌株HMQ20YJ11與萎縮芽孢桿菌序列相似性最高，形成了一個獨立的類群（圖1），據此將菌株HMQ20YJ11鑒定為萎縮芽孢桿菌。

2.3" "菌株HMQ20YJ11的離體防病促生相關活性

在1%羧甲基纖維素和7%脫脂牛奶的培養基中，接種點周圍形成清晰的光暈，表明該菌株產生纖維素酶和蛋白酶。在淀粉瓊脂平板上接種點周圍形成清晰的光暈，表明該菌株產生α-淀粉酶。菌株HMQ20YJ11在添加1%果膠的基礎培養基中接種點周圍形成明顯的光暈，表明其產生果膠酶。在鉻azurol S （CAS）試驗中，7 d后，它在培養基中產生橙色暈，表明產生了鐵載體。菌株HMQ20YJ11在含磷酸三鈣的PVK固體培養基中接種點周圍形成清晰的光暈，表明該菌株具有溶解磷的能力。從奈斯勒試劑顏色變化可以看出，菌株HMQ20YJ11產生氨。比色法檢測IAA的結果表明，菌株HMQ20YJ11在添加L-色氨酸的液體培養基中生長72 h后，產生了濃度為31.37 μg/mL的IAA（圖2）。

2.4" "溫室試驗評價菌株HMQ20YJ11的防病效果

采用苗盤試驗和盆栽試驗觀察了菌株HMQ20YJ11對辣椒疫病的防控效果。可以看出，經菌株HMQ20YJ11發酵液處理的辣椒植株病害嚴重程度顯著低于未處理，其效果優于生物殺菌劑枯草芽孢桿菌。菌株HMQ20YJ11發酵液處理的防控率分別為52.59%、56.42%，枯草芽孢桿菌處理的防控率分別為28.45%、34.84%，氟啶胺處理的防控率分別為14.81%、77.42%（圖3）。

2.5" "田間試驗評價菌株HMQ20YJ11的防病效果

從人工接種田間試驗測定菌株HMQ20YJ11對辣椒疫病的防治效果可以看出，接種辣椒疫霉菌后第15天，菌株HMQ20YJ11對辣椒疫病的防控效果為（66.58±1.82）%，枯草芽孢桿菌和氟啶胺的防控效果分別為（34.29±3.40）%、 （81.39±2.67）%（圖4）。

3" "討論與結論

農作物生產需要保護作物免受病原菌的危害，否則會降低產量和質量。目前，為了避免和控制病原菌，種植者通常在很大程度上依賴化學藥劑，然而，化學藥劑的廣泛使用會造成各種負面影響。因此，取而代之的是更環保、更安全的植物保護方法，特別是利用有益微生物的生物防治方法［20 ］。在這些有益微生物中，芽孢桿菌占主導地位，越來越多的菌株被用作不同作物的生物肥料或生物農藥。本研究從甘肅民勤縣鹽堿化地塊土壤中分離到1株潛在的萎縮芽孢桿菌HMQ20YJ11。平板對峙培養試驗表明，菌株HMQ20YJ11對灰葡萄孢菌、松針刺盤孢菌、禾谷鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌、輪枝鐮刀菌、辣椒疫霉菌、立枯絲核菌和核盤菌的菌絲生長有較強的抑制作用。此外，菌株HMQ20YJ11可產生水解酶，如纖維素酶、蛋白酶、α-淀粉酶、果膠酶和鐵載體，以及具有溶解磷酸鹽的能力，這是拮抗細菌的共同特征［21 ］。菌株HMQ20YJ11對植物病原菌的抑制作用可能與纖維素酶、蛋白酶、α-淀粉酶、果膠酶和鐵載體等酶復合物的作用有關。芽孢桿菌產生纖維素酶、蛋白酶、果膠酶和鐵載體，使菌絲破裂和變形，導致細胞結構和功能的改變［22 - 24 ］。此外，本研究分離到的菌株HMQ20YJ11也具有多種促生特性，IAA能顯著促進植物生長。溶解磷酸鹽能有效增加植物對磷的吸收，促進根系發育；鐵載體是由微生物產生的鐵螯合物，對作物生長至關重要。產生鐵載體的細菌通過限制病原菌的鐵供應來減緩病原菌的生長［25 ］。因此，菌株HMQ20YJ11可控制辣椒疫病，促進辣椒植株生長。

田間試驗結果表明，菌株HMQ20YJ11顯著降低了辣椒疫病的發病率，防控效果優于枯草芽孢桿菌。然而，溫室試驗和田間試驗結果都表明，拮抗微生物對病害發生率的影響不同，菌株HMQ20YJ11優于枯草芽孢桿菌和氟啶胺。因此，篩選具有抑病促生作用的拮抗微生物是提高辣椒生長和產量的有效措施。然而，基本的環境條件，如溫度和濕度，會極大地影響植物、病原菌和微生物菌劑之間的相互作用，這些影響都可能影響生物防治的效果［26 - 27 ］。綜上所述，菌株HMQ20YJ11對辣椒疫病具有較好的防控效果，該菌株的應用可為辣椒疫病的生物防治提供支持。

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收稿日期：2022 - 08 - 09

基金項目：甘肅省農業科學院農業科技創新專項（2020GAAS24、2021GAAS54）；甘肅省農業科學院科技成果轉化項目（2021GAAS-CGZH01）；蘭州市科技計劃項目（2021-1-174）；甘南州科技計劃項目（2021-2）。

作者簡介：郭致杰（1972 — ），男，甘肅民勤人，副研究員，主要從事農業外來入侵物種和農業有害生物綜合防控技術研究工作。Email：guozhijie@gsagr.ac.cn。