小白蛋白在新生大鼠缺氧后癲癇易感性升高中的作用機制

孫衛文，詹麗璇， 曾 瑋，徐 恩

缺氧是導致新生兒缺氧性腦病和癇性發作的主要原因。新生兒期或圍產期缺氧的患兒成年后對致癇因素的敏感性升高［1］，其機制尚未明確。過度的Ca2+內流是導致細胞缺氧性損傷的關鍵因素。缺氧后，興奮性神經元被激活，促進Ca2+內流，對細胞起毒性作用，抑制性神經元則反之。小白蛋白(parvalbumin，PV)是鈣結合蛋白超家族中的一種，對Ca2+有很高的親和力，能結合細胞內游離鈣，緩沖Ca2+，對抗細胞內鈣超載［2］和維持神經元網絡的穩定［3］。本研究選用新生大鼠缺氧誘導癇性發作模型，觀察缺氧后海馬PV的表達，并檢測海馬Ca2+熒光強度，初步探討PV在新生大鼠缺氧后癲癇易感性升高中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象

新生10 d的Sprague-Dawley(SD)大鼠128只(由中山大學醫學院實驗動物中心提供)，置于光照∶黑暗=12∶12標準光照周期的動物房喂養，母鼠與同窩新生大鼠同籠飼養。所有實驗動物的操作及飼養均符合中華人民共和國實驗動物管理條例。新生大鼠分為缺氧組和對照組，每組64只。

1.2 研究方法

1.2.1 制備缺氧性癇性發作模型 缺氧組采用改良的新生大鼠缺氧性癇性發作模型［4］，大鼠置于恒溫34℃的大小9000 cm2的密閉箱內，連續通入含有5%氧氣、95%氮氣的混和氣體，對照組通入常氧(21%氧氣、89%氮氣的混和氣體)，共通氣17 min。大鼠在進行缺氧時出現面部痙攣、節律點頭、跌倒等表現。根據經典的Racine標準［2］對動物表現進行分級。出現全身性驚厥或大發作表現(即4、5級)的大鼠為入組標準。本研究中缺氧組大鼠缺氧時強直性陣攣發作表現較一致，重復性好，所有大鼠評分達到4、5級。

1.2.2 腦組織取材 分別于缺氧/常氧處理后1 d、3 d、7 d和14 d 2組各取16只大鼠取腦組織。麻醉后(用于流式細胞術檢測的大鼠采用脊椎牽引脫臼法處死)于冰臺上迅速分離海馬組織，液氮快速冷凍后保存于－70℃冰箱中。另外，大鼠麻醉后用4℃生理鹽水經心臟快速灌注，隨后用4℃的4%多聚甲醛以先快后慢的速度固定，取腦經后固定、梯度蔗糖多聚甲醛溶液脫水、冰凍切片(片厚40 μm)后，選取相鄰海馬區腦片。各組中6只大鼠腦組織用于免疫組化，4只用于Western Blot，6只用于流式細胞術。

1.2.3 Nissl染色 1%焦油紫溶液染色15 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片。

1.2.4 免疫組化 腦片用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 值 7.4)洗 3 次各 5 min，3%H2O2室溫孵30 min，加入稀釋的鼠來源單克隆抗體PV(1∶8 000;Chemicon)，4℃振蕩孵育過夜。PBS洗3次，加入含生物素標記的羊抗鼠第二抗體，室溫孵育2 h，PBS洗3次各5 min，加入含辣根過氧化物酶復合物，室溫孵育30 min。PBS洗3次各5 min，DAB顯色。梯度酒精脫水，透明，封片。

1.2.5 Western Blot 組織按 1 mg∶50 μl比例加入預冷的全細胞裂解液，勻漿后裂解30 min，20 000 r/min離心30 min(4℃)后提取上清液即為細胞總蛋白。BCA法進行蛋白定量。各組分別取等量的全細胞蛋白，用10%的 SDS聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)進行電泳。100 V恒壓轉膜3 h。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，TTBS漂洗10 min，3次，與一抗(PV 1∶8 000;β-actin 1∶1 000)4℃孵育過夜。二抗(羊抗鼠IgG 1∶1 000)室溫反應1 h。ECL反應4 min后，暗室進行X-光膠片曝光、顯影和定影。

1.2.6 流式細胞術 腦組織用0.25%胰蛋白酶消化30 min，以Dulbecco改良Eagle培養基(DuI-becco’s modified eagIe’s medium，DMEM)終止消化，過200目篩網，1000 r/min離心5 min。取細胞沉淀用Hanks液漂洗，離心5 min，將細胞沉淀用DMEM培養基制成密度為105～106細胞懸液，加入終濃度為5 μmol/L的fluo-3AM，置入37℃水浴箱中避光緩慢勻速50次/min振蕩孵育30 min。1 000 r/min離心5 min，棄上清，Hanks液漂洗，如此2次。最后用含10%新生牛血清的DMEM制成密度105～106的細胞懸液。以X軸為熒光強度，Y軸為細胞數，以組方圖檢測樣品的平均熒光強度值來表示神經元內［Ca2+］i的相對濃度大小。計算機存檢數據，檢測條件(包括負載時間、熒光劑強度、溫度、電壓等)保持恒定。

1.3 數據采集

在光學顯微鏡(×200)下，選取雙側海馬CA1區、CA3區和DG區各3個連續視野，用Image J軟件計數PV免疫陽性細胞數，每只大鼠共選取6張典型背側海馬腦片，計算其均數以精確實驗數據。Western Blot X線膠片用Quantity One計算機圖像分析系統分析，測定目標帶灰度值，并以對照1 d組的灰度值為標準進行校正。

1.4 統計學方法

采用SPSS11.5進行統計分析。缺血組與對照組間的比較采用兩因素(處理因素與時間因素)方差分析。進一步在同一處理組內不同時間點的比較用單因素方差分析，兩兩之間的分析采用Bonferreoni檢驗;相同時間點兩組之間的比較采用獨立樣本的t檢驗。檢驗水準α為0.05。

2 結果

Nissl染色結果顯示，缺氧組中海馬各區細胞結構完整，胞漿內尼氏體無明顯改變，未見細胞死亡。對照組海馬各區細胞排列緊密，形態結構正常。

2.1 大鼠海馬各區域PV免疫組化結果

圖1 大鼠對照組(A～D)與缺氧組(E～H)海馬PV免疫組織化學結果圖

缺氧組和對照組海馬各區均可見棕褐色PV免疫陽性細胞(見圖1)。PV陽性神經元胞體及突起清晰可見，主要分布于海馬CA1區的始層、CA3區的錐體細胞層和輻射層、齒狀回的顆粒細胞層以及門區，可見有部分神經元的突起貫穿整個錐體細胞層。

各區域PV陽性細胞數如表1～表3所示。CA1區PV免疫陽性細胞數經兩因素方差分析示，處理(缺氧與對照)主效應(F=53.87，P ＜0.01)、時間主效應(F=29.124，P ＜0.01)和兩者交互效應(F=12.19，P ＜0.01)均有統計學意義。CA3區，處理主效應(F=38.50，P ＜0.01)、時間主效應(F=19.96，P ＜0.01)和兩者交互效應(F=5.98，P ＜0.01)有統計學意義。

DG 區，處理主效應(F=56.28，P ＜0.01)、時間主效應(F=28.06，P ＜0.01)和兩者交互效應(F=8.05，P ＜0.01)亦均有統計學意義。

缺氧組內，CA1區(F=5.69，P=0.02)、CA3區(F=6.28，P=0.02)、DG 區(F=3.41，P=0.04)各時間點PV免疫陽性細胞數有統計學差異，3 d和14 d均較1 d和7 d高(均P＜0.05)。對照組內，各時間點 CA1區(F=53.87，P ＜0.01)、CA3區(F=38.50，P ＜0.01)、DG 區(F=40.50，P ＜0.01)PV 免疫陽性細胞數亦有統計學差異，3 d、7 d和14 d均較1 d高(均P＜0.05)。與相應時間點對照組相比，在CA1區、CA3區和DG區，缺氧組PV免疫陽性細胞數7 d、14 d均降低(均 P ＜0.05)，而缺氧1 d、3 d 與對照組比較差異無統計學意義(均P＞0.05)。

2.2 大鼠海馬PV蛋白的含量

如圖2和表4所示:海馬PV的含量經兩因素方差分析示處理主效應(F=6.31，P＜0.01)和時間主效應(F=8.71，P ＜0.01)有統計學意義，兩者交互效應有統計學意義(F=14.02，P ＜0.01)。

缺氧組內，海馬各時間點PV含量無統計學差異(F ＜0.01，P=0.98)。對照組內，各時間點 PV 含量有統計學差異(F=6.31，P ＜0.01)，3 d、7 d 和 14 d均較1 d高(均P＜0.05)。與相應時間點對照組相比，缺氧組3 d PV的含量增加，而7 d和14 d均降低(均 P ＜0.05)。

2.3 大鼠海馬神經元內的Ca2+熒光強度

海馬神經元內Ca2+熒光強度經兩因素方差分析示，處理主效應(F=10.10，P ＜0.01)和時間主效應有統計學意義(F=10.19，P ＜0.01)，兩者交互效應有統計學意義(F=5.41，P=0.03)。缺氧組內，海馬神經元內Ca2+熒光強度有統計學差異(F=9.23，P ＜0.01)，3 d和7 d均較1 d降低(均 P ＜0.05)。對照組內，各時間點海馬神經元內Ca2+熒光強度無統計學差異(F=2.23，P=0.1)。與相應時間點對照組相比，缺氧組海馬神經元內Ca2+熒光強度均增加(均 P ＜0.01)(見表5)。

圖2 各組海馬PV Western Blot結果比較

表1 對照組與缺氧組大鼠海馬CA1區PV免疫陽性細胞計數的比較()

表1 對照組與缺氧組大鼠海馬CA1區PV免疫陽性細胞計數的比較()

與1 d比較，經Bonferroni法檢驗*P＜0.05;與7 d比較，經Bonferroni法檢驗#P＜0.05;與相同時間點的對照組比較，經獨立樣本t檢驗△P ＜0.05

1 d 3 d 7 d 14 d缺氧組對照組組別17.67 ±5.39 12.67 ±4.97 36.50 ±3.27*#31.33 ±6.38*19.17 ±3.813)32.83 ±6.94*34.00 ±3.69*#△44.00 ±3.29*

表2 對照組與缺氧組大鼠海馬CA3區PV免疫陽性細胞計數的比較()

表2 對照組與缺氧組大鼠海馬CA3區PV免疫陽性細胞計數的比較()

與1 d比較，經Bonferroni法檢驗*P＜0.05;與7 d比較，經Bonferroni法檢驗#P＜0.05;與相同時間點的對照組比較，經獨立樣本t檢驗△P ＜0.05

1 d 3 d 7 d 14 d缺氧組對照組組別14.83 ±5.35 13.50 ±3.78 30.00 ±6.69*#26.17 ±5.35*17.67 ±5.16△28.17 ±5.27*31.83 ±5.08*#△41.83 ±5.31*

表3 對照組與缺氧組大鼠海馬DG區PV免疫陽性細胞計數的比較()

表3 對照組與缺氧組大鼠海馬DG區PV免疫陽性細胞計數的比較()

1 d 3 d 7 d 14 d缺氧組對照組組別17.00 ±9.78 11.50 ±5.99 42.33 ±3.08*#17.00 ±9.78*25.33 ±3.45△37.50 ±5.75*33.83 ±3.55*#△42.83 ±5.57*

與1 d比較，經Bonferroni法檢驗*P＜0.05;與7 d比較，經Bonferroni法檢驗#P＜0.05;與相同時間點的對照組比較，經獨立樣本t檢驗△P ＜0.05

表4 缺氧組與對照組大鼠海馬PV蛋白含量的比較()

表4 缺氧組與對照組大鼠海馬PV蛋白含量的比較()

與1 d比較，經Bonferroni法檢驗*P＜0.05;與相同時間點的對照組比較，經獨立樣本的t檢驗#P＜0.05

1 d 3 d 7 d 14 d缺氧組對照組組別177.98 ±40.58 100.00 ±0.00 153.24 ±12.22#133.75 ±12.45*124.67 ±31.32#175.26 ±24.26*163.43 ±26.36#211.73 ±26.43*

表5 缺氧組與對照組大鼠海馬神經元內Ca2+熒光強度的比較()

表5 缺氧組與對照組大鼠海馬神經元內Ca2+熒光強度的比較()

與1 d比較，經Bonferroni法檢驗*P＜0.05;與相同時間點的對照組比較，經獨立樣本的t檢驗#P＜0.05

組別323.87 ±53.03#213.95 ±23.57 1 d 3 d 7 d 14 d缺氧組對照組362.57 ±92.78#210.17 ±74.12 192.03 ±36.93*#146.62 ±19.69 266.77 ±77.96*#163.97 ±48.89

3 討論

缺氧造成的癲癇樣發作多發生于兒童［5］。故新生大鼠缺氧誘導癇性發作模型是研究腦缺氧的理想方法之一。本研究通過建立新生大鼠缺氧誘導癇性發作模型，分別選擇缺氧誘導癇性發作后不同的時間點，在國內外首次觀察海馬中 PV及神經元內Ca2+熒光強度的變化。

PV對 Ca2+有高度親和力，能夠緩沖細胞內Ca2+，保護神經元免受由于電壓依賴性鈣濃度過高而產生的損害，因而在中樞神經系統損傷后起著重要保護作用。本研究結果顯示，在海馬CA1區、CA3區及DG區缺氧后7～14 d PV陽性神經元表達減少，海馬PV含量在缺氧后3 d較對照組增加，7～14 d則明顯減少。提示缺氧誘導癇性發作后7～14 d在海馬各區的PV神經元均受損。缺氧后3 d PV表達增加可能與缺氧后細胞內Ca2+迅速增加促使PV表達增加以加強對Ca2+的緩沖能力有關。Fagel等［6］對生后3～10 d的小鼠給予慢性缺氧，發現在缺氧后1 m皮質PV陽性神經元較正常減少;Wittner等［7］的研究發現，在顳葉癲癇患者的海馬非硬化CA1區PV在胞體的表達減少，嚴重海馬硬化的癲癇患者海馬CA1區僅有少量 PV陽性細胞表達。Schwaller等［8］的研究發現，在戊四氮誘導癇性發作模型中，PV－/－基因型動物癲癇發作程度要比PV+/+嚴重，推測由于PV神經元功能或數量的減少導致大鼠癲癇易感性升高。結合我們前期研究結果［9］，推測PV神經元的損傷及含量的減少是γ-氨基丁酸在缺氧導致新生大鼠癲癇易感性升高中起作用的機制之一。其機制可能與對細胞內Ca2+緩沖能力減弱、神經元興奮性增高及影響γ-氨基丁酸能中間神經元的快速放電能力，減弱對錐體細胞的抑制性有關。

缺氧后細胞內外離子穩態失衡造成細胞死亡。Silver等［10］的研究發現，在正常情況下神經元內Ca2+濃度為 10－8～10－7mol/L，且各腦區間無明顯差別，然而在缺氧或血流阻斷30～60 s后，在皮質觀察到微小的細胞內Ca2+增加，而海馬CA1區神經元內Ca2+濃度可明顯增加至6×10－4～8×10－4mol/L。研究已證明，癲癇灶腦細胞內Ca2+濃度升高達閾限以上是癲癇發生和癲癇腦損害的直接原因。本研究顯示:與各時間點的對照組相比，缺氧組海馬神經元內Ca2+熒光強度明顯增高，且缺氧后1 d海馬神經元內Ca2+熒光強度高于缺氧后3 d及7 d，提示缺氧后海馬神經元內Ca2+濃度迅速增加，我們推測由于PV神經元發育尚不完全，因此缺氧后1 d海馬神經元內Ca2+濃度明顯增高，并且刺激海馬PV神經元的表達以適應神經元內Ca2+濃度的增加，隨著PV神經元的發育及代償性增加，其對Ca2+的緩沖能力增加，細胞內Ca2+濃度逐漸下降，但是在缺氧后7 d時，PV神經元明顯減少，對抗Ca2+超載能力減弱，不能有效地緩沖細胞內Ca2+導致缺氧后14 d時出現細胞內Ca2+濃度較缺氧后3 d升高。因此我們認為缺氧對其所致的Ca2+超載導致神經元興奮性增加，是引起癲癇發作的機制之一。由于實驗條件及動物模型的限制，本研究未能對海馬進行分區檢測神經元內Ca2+熒光強度。

綜上所述，我們推測新生大鼠缺氧誘導癇性發作后PV神經元的損傷、對細胞內游離Ca2+緩沖能力減弱、影響中間神經元的快速放電能力，減弱對錐體細胞的抑制，最終導致海馬神經元興奮性增加是PV在新生大鼠缺氧誘導癇性發作后癲癇易感性升高中起作用的機制之一。缺氧后細胞內游離Ca2+增加可能是導致PV神經元損傷的原因之一。

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