影響根尖牙乳頭干細胞成骨和成牙本質方向分化的因素

馬振寰 崔彩云 李言君

[摘要]根尖牙乳頭干細胞是一類具有自我更新能力和多向分化潛能的牙源性間充質干細胞，是牙根部成牙本質細胞的重要來源，在牙根部牙本質的發育中發揮重要作用，其在多種因素作用下能夠向成骨和成牙本質方向分化，具有形成牙髓-牙本質復合體的能力。誘導根尖牙乳頭干細胞成骨和成牙本質方向分化，尤其是促進根尖孔未閉合的年輕恒牙牙根繼續發育，對于患牙保存具有重要意義。本研究從生物活性材料及支架、炎癥微環境、物理化學因素和基因轉染等方面回顧了影響根尖牙乳頭干細胞成骨和成牙本質方向分化的誘導因素，其中細胞外基質材料、硅酸鹽類生物活性材料和炎癥微環境的相關研究對牙髓-牙本質復合體再生具有更顯著的作用優勢。

[關鍵詞]根尖牙乳頭干細胞;成牙本質細胞;成牙本質分化;成骨分化

[中圖分類號] R781.3? [文獻標識碼] A?? [文章編號]2095-0616（2022）08-0048-04

2006年Sonayama等首次分離根尖牙乳頭細胞，命名為根尖牙乳頭干細胞（stem cell from the? apical papilla， SCAP），這類細胞具有多向分化潛能，是牙根部成牙本質細胞的重要來源，在牙根部牙本質的發育中發揮重要作用[1]。牙根未完全發育的年輕患牙因牙髓和根尖周炎癥造成牙根發育停滯，在實施根尖誘導成形術后，根尖周組織中的根尖牙乳頭干細胞等能夠作為干細胞來源促進牙根的延長和管腔的縮窄促進牙根發育。探尋促進根尖牙乳頭干細胞成骨和成牙本質方向分化的理想誘導微環境，對實現再生牙髓-牙本質復合體用于治療牙髓及根尖周病的年輕恒牙具有重要意義。

1生物活性材料

1.1 生長因子

生長因子是一類通過與特異的、高親和的細胞膜受體結合，調節細胞生長與其他細胞功能等多效應的多肽類物質，近年研究主要涉及轉化生長因子-β（transforming growth factor-β， TGF-β）、甲狀旁腺激素（parathyroid hormone， PTH）和1，25-二羥基維生素 D3。TGF-β是一種具有多種生物學功能的細胞因子，1 ng/ml TGF-β2體外促進人 SCAP 牙本質涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein， DSPP）和牙本質基質蛋白1（dentin matrix protein 1， DMP-1）表達，抑制骨涎蛋白（bone sialoprotein， BSP）表達， TGF-β2體外促進 SCAP 成牙本質方向分化[2]。PTH 促進人 SCAP 體外細胞增殖、骨鈣素（osteocalcin， OCN）、骨橋蛋白（osteopontin， OPN）、osterix（OSX）、runt-related transcription? factor 2（RUNX2）、膠原蛋白Ⅰ型（collagen type Ⅰ， COL-I）、DSPP 基因和蛋白表達，促進 SCAP 成骨和成牙本質方向分化[3]。1，25-二羥基維生素 D3 是調節人體鈣磷代謝的重要激素，也是細胞生長分化、免疫系統功能和中樞神經系統功能的關鍵調節因子，體外促進 SCAP 黏附、增殖和 Runx2、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase， ALP）、COL-I 和 OCN 表達，促進 SCAP 成骨方向分化[4]。

1.2 細胞外基質

細胞外基質富含多種細胞因子、生物活性蛋白等在促進 SCAP 成骨成牙本質方向分化中具有重要的作用。近年來的相關研究主要包括人血小板裂解物（human platelet lysate， HPL）、血小板衍生生長因子 BB（platelet derived growth factor， PDGFBB）、富血小板纖維蛋白（platelet rich fibrin， PRF）和濃縮生長因子（concentrate growth factors， CGF）。HPL 是一種來源于人血小板的無異種源、無動物血清的產物，含有細胞生長所需的所有生長因子和蛋白質，HPL 體外促進接種于 PLGA 支架的 SCAP 增殖、黏附和 ALP、OPN、OCN 表達[5]。 PDGFBB 體外促進 SCAP 的增殖， PDGFBB 水凝膠促進大鼠顱骨缺損模型中新骨的形成和礦化[6]。 PRF 含大量生長因子和細胞因子，CGF 是新一代血漿提取物，富含濃縮生長因子和纖維蛋白，在骨再生方面優于 PRF。PRF 條件培養液顯著促進SCAP 體外遷移、ALP、DMP-1表達和礦化結節的形成， PRF 通過 ERK 信號通路促進 SCAP 成骨和成牙本質方向分化[7]。

1.3 無機生物活性材料

常用的生物活性材料為硅酸鹽生物活性材料，如三氧化二礦物集合體（mineral trioxide aggregate， MTA）、BD（bio-dentin）、ProRoot、iRoot Fast Set? root repair material（iRoot FS）等。MTA 通過激活 p38和 ERK 信號通路促進 SCAP 向成骨方向分化[8]。IRoot FS 增強 SCAP 礦化能力，促進 DSPP、ALP 基因和蛋白表達，作用優于 MTA[9]。硅酸鹽材料促進 SCAP 體外礦化、成骨和成牙本質方向分化[10-11]。這些硅酸鹽材料體外誘導 SCAP 的礦化、成骨和成牙本質方向分化，從而促進其在再生性牙髓治療中的應用。

目前，細胞因子、細胞外基質及其支架材料并未廣泛應用于臨床。大量研究表明 SCAP 體外有很強的成骨和成牙本質方向分化能力，但缺乏動物異位及臨床原位再生的研究。TGF-β2具有抑制骨形成和促進成牙本質方向分化的能力，對于牙髓-牙本質復合體再生研究具有重要研究價值;血液來源的 HPL、PDGFBB、PRF 和 CGF 有良好的臨床應用前景，需要大量實驗研究提供臨床應用基礎;硅酸鹽材料可刺激膠原、前列腺素等基因上調誘導細胞產生更多的礦化基質，其生物相容性及生物安全性在臨床中被廣泛認可，且已取得了良好的臨床治療效果，具有良好的應用前景，其作用機制有待進一步明確。

2炎癥微環境

由于炎癥因子的表達及抗菌成分的不同， SCAP 在炎癥微環境下的分化也會受到影響，目前研究的影響因素主要有脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）和抗菌肽等。LPS 是革蘭陰性菌的主要成分，在成牙本質細胞、成纖維細胞、牙髓干細胞和 SCAP 中作為內毒素誘導多種免疫反應。0.1μg/ml LPS 促進 SCAPs 細胞增殖、ALP 活性、礦化結節形成和 DSPP、RUNX2、BSP 表達，通過 ERK 和 P38信號通路促進 SCAPs 成骨和成牙本質方向分化[12]。5 mg/ml LPS 可抑制 SCAP 細胞增殖、礦化結節形成和 DMP-1、RUNX-2和 ALP 的表達，5 mmol/L 的自噬抑制劑3-MA 逆轉 LPS 引起的礦化結節形成和 DMP-1、RUNX-2和 ALP 的表達，證實細胞自噬在 LPS 誘導的炎癥環境中參與 SCAP 成骨和成牙本質方向分化的抑制[13]，自噬調節可能作為一種新的策略，促進 SCAP 在炎癥環境下的成骨和成牙本質方向分化。1μg/ml 和5μg/ml LPS 增強小于根發育期的1/2的 SAPC（ER-APC）礦化能力和 BSP 表達，但1μg/ml 對根發育期的1/2～3/4 SAPC（LR-APC）的礦化及 BSP 表達無影響能力無影響，5μg/ml 可以促進 LR-APC BSP 表達，對礦化無影響，不同濃度的 LPS 可對 SCAPs 產生不同的影響，相同濃度的 LPS 在 SCAPs 不同時期產生的影響有差異[14]。抗菌肽 LL-37除了具有廣譜的抗菌功能，還能促進牙齒形成和成骨，2.5 mg/ml LL-37促進 SCAP 的 DSP、 DMP-1、RUNX2、OSX 表達，2.5 mg/ml LL-37通過激活 Akt/Wnt/β-catenin 信號通路促進 SCAPs 遷移和成骨和成牙本質方向分化[15]。綜上所述， SCAP 在體外模擬的炎性環境下受到影響與受到 LPS 濃度及作用時間有明顯相關性，研究多為細胞學實驗未見動物實驗及臨床報道。細胞代謝產物及抗菌成分與 SCAP 存在復雜的相互作用，探索如何控制炎癥減輕或消除其對 SCAP 成骨和成牙本質方向分化的抑制作用具有重要意義。

3其他因素

3.1 物理因素

影響根尖牙乳頭細胞分化的物理因素包括環境微剛度、支架彈性模量、光照等。SCAP 通過改變其細胞形態和細胞骨架來響應不同的底物硬度纖維連接蛋白與黏著斑塊中的黏著斑激酶（FAK）和帕西林相互作用，并且 FAK 和帕西林的表達隨著底物硬度的增加而增強[16]。多孔絲素支架的彈性模量（elastic modulus of porous silk fibroin? scaffolds）基質的物理性質（彈性模量）將成為干細胞分化為不同譜系的重要因素，SCAP 對海綿基質模量在16～131 kPa 范圍內表現出成骨敏感性， OPN、RUNX2、OCN 表達上調，多孔支架的成骨能力隨彈性模量的增加而增強，模量為83 kPa 的支架成骨能力最強[17]。低能量藍光照射促進 SCAP 的成骨分化，上調 ALP、DSPP、DMP-1和 OCN 的表達水平[18]。200 g 機械牽張力能促進 SCAP 成牙本質方向分化，提高 ALP、OSX、DSP mRNA 及蛋白的表達水平[19]。

3.2 化學因素

影響根尖牙乳頭細胞分化的化學藥物主要包括氟化鈉、信號通路抑制劑等。0.5 mM NaF促進 SCAP 礦化結節形成和 RUNX2、OSX、DSP、OCN 表達[20]。100 mg/L 乙酰水楊酸誘導 SCAP 后聯合 PI3K-AKT 信號通路抑制劑 LY294402可以促進礦化結節形成，促進 SCAP 成牙本質方向分化[21]。毛喉素（Forskolin）和 TGF-β1抑制劑共處理可提高 SCAP 的 ALP 活性和鈣礦物的沉積[22]。

3.3基因轉染相關因子

基因轉染技術是將純化的含靶基因的質粒DNA轉移至細胞內，使其在細胞內表達并發揮一定的功能。近年的研究主要集中在cAMP反應元件結合蛋白123、微核糖核酸hsa-let-7（ MicroRNAhsa-let-7 ）24-25]、分泌型卷曲相關蛋白2（ secretedfrizzled-related protein 2，SFRP2 ）[26l、無遠端同源盒5 （distal-less homeobox 5，DLX5 ） 127。這部分研究結果為SCAP成骨和成牙本質方向分化的功能調控機制提供實驗基礎，是作用機制研究的常用手段依據，但動物實驗及臨床應用受到局限。

4總結與展望

綜上所述，誘導根尖牙乳頭干細胞成骨和成牙本質方向分化的影響因素主要包括生物活性材料及支架、炎癥微環境、物理化學因素和基因轉染等。上述研究中使用的細胞主要來源于鼠和人，可以根據獲取的難易程度以及實驗需求選擇組織來源;體外研究中主要通過ALP染色、Realtime-PCR、Western blot等方法定量檢測相關指標表達量的高低來確定細胞成骨和成牙本質方向分化;SCAP成骨和成牙本質方向分化過程復雜、涉及Akt、Wnt和NF- xB等多條信號通路。目前尚未有文獻報道明確某一指標升高或降低高即根尖牙乳頭干細胞發生成骨方向分化或成牙本質方向分化。無免疫源性的血液來源細胞外基質材料、硅酸鹽類生物活性材料或兩者材料的混合，炎癥微環境的相關研究有望成為牙髓-牙本質復合體再生臨床轉化應用的理想誘導微環境。

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（收稿日期：2021-11-15）