焦亡與缺血性腦卒中關系的研究進展

魯明 郭帥 劉恒興

[摘要]焦亡是一種炎癥類型的程序性細胞死亡方式，發生于炎癥小體激活后。焦亡直接由最近發現的一個被稱為Gasdermin（GSDM）的成孔蛋白家族調節，其最具特征的是Gasdermin D（GSDMD）。最近的研究表明焦亡與多種神經系統病變的發病機制有關，尤其在缺血性腦卒中的病理發展中，焦亡有廣泛的參與。本文主要討論誘發焦亡的分子機制和發生缺血性腦卒中時焦亡的分子靶點，以期為缺血性腦卒中后腦損傷的治療及預后提供新的策略。

[關鍵詞]焦亡;炎癥小體;Gasdermin D;缺血性腦卒中

[中圖分類號] R743.3? [文獻標識碼] A?? [文章編號]2095-0616（2022）08-0060-04

Research progress on the relationship between pyroptosis andischemic stroke

LU? MingGUO? ShuaiLIU? Hengxing1

1. Department of Human Anatomy and Histoembryology， Xinxiang Medical University， Henan， Xinxiang 453000， China;2. Laboratory ofHuman Anatomy， Sanquan College ofXinxiang Medical University， Henan， Xinxiang 453000， China?? [Abstract] Pyroptosis is a type of inflammatory programmed cell death that occurs after the activation of inflammasome. Pyroptosis is directly regulated by a recently discovered pore-forming protein family called gasdermin （GSDM）， the most characteristic of which is gasdermin D （GSDMD）. Recent studies have shown that pyroptosis is related to the pathogenesis of a variety of nervous system diseases， especially the ischemic stroke. This paper mainly discusses the molecular mechanism of inducing pyroptosis and the molecular targets of pyroptosis in ischemic stroke， in order to provide a new strategy for the treatment and prognosis of brain injury after ischemic stroke.

[Key words] Pyroptosis; Inflammasome; Gasdermin D; Ischemic stroke

程序性細胞死亡是一種大腦發育、維持體內激素水平以及清除感染或轉化細胞的重要特征。程序性細胞死亡存在12種類型，從非炎癥性（如凋亡）至高度促炎性（如焦亡），每種類型由獨特的分子特征定義。程序性細胞死亡從根本上不同于壞死，壞死是瞬間的、災難性的，無法通過藥理學或基因干預口。

細胞凋亡是由微環境的擾動引起的并由半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）活化，主要是caspase-3 的活化，這類細胞死亡方式在中樞神經系統中已被深入研究2]。然而非凋亡性炎性細胞死亡作為神經退行性變的重要決定因素越來越受到重視，特別是促炎癥和溶解性細胞程序性死亡一焦亡，已成為神經系統疾病的關鍵因素，與很多神經系統疾病相關，如缺血性腦卒中。了解焦亡和這類疾病的關系，探索缺血性腦卒中的細胞死亡途徑是開發有效治療方法的基礎。

1 焦亡的分子機制

與凋亡不同，焦亡是溶解性、促炎癥的，其特征是形成損害膜完整性的膜孔。焦亡依賴于細胞死亡的執行者-Gasdermin（GSDMD）蛋白質，其中 GSDMD蛋白的發現，將人們對焦亡的認識引領到一個新的高度13—51。此外，焦亡是由caspase—1引起的，Caspase—1在形成炎癥小體的細胞溶質多聚體平臺上被激活，這種分子主要通過保守蛋白質結構域之間的相互作用獲得[6—71，它們是炎癥小體激活焦亡下游的主要驅動因素。炎癥小體分為標準的或非標準的，具體取決于caspase—1是否與之結合，炎癥小體的激活是介導后續GSDMD蛋白活化和細胞焦亡的關鍵步驟。標準和非標準的炎癥小體都可以直接介導GSDMD裂解18—121，因此可在GSDMD介導的細胞焦亡的分裂中充當重要的檢查點。

最初使用人和小鼠細胞確認GSDMD為焦亡劊子手是為了回應經典和非經典炎癥小體活化113—15]。多項研究證實了GSDMDN端活化具有成孔的能力，而 GSDMD C 端自身抑制性作用也被提出[16-20]。雖然 GSDMD 在許多細胞類型中均有表達，但轉錄因子干擾素調節因子2（interferon regulatory factor 2， IRF2）可控制 GSDMD 的轉錄表達，其轉錄上調在某些細胞類型中是必需的，以提高蛋白質水平，誘導焦亡[21]。但在中樞神經系統，IRF2是否是驅動 GSDMD 表達的唯一轉錄因子，以及它是否是 GSDMD 介導焦亡的重要調節因子目前尚不清楚。雖然 GSDMD 家族的其他成員最近已經被確定（如 GSDME），但 GSDMD 是焦亡最顯著的特征，仍是本文討論的重點。

2焦亡途徑

從歷史上看，是否依賴 caspase-1家族蛋白酶被認為是焦亡的定義特征。發現 GSDMD 后，對焦亡的定義進行了修訂，包括依賴 GSDMD 作為必需的分子特征和依賴 caspase-1家族兩種特性，但也發現其他 caspase 家族成員，包括 caspase-3和 caspase-8也可以處理 GSDMD，導致焦亡。 Caspase-8在活化轉化生長因子（TGF）b-抑制激酶-1（TAK1）的情況下切割并激活 GSDMD，促使對依賴于 caspase-1家族蛋白酶的焦亡的定義進行重新評估。在體外，重組 caspase-8可裂解小鼠和人的 GSDMD，盡管效率低于重組 caspase-1[5]。正如對神經營養體的幾項研究發現所強調的那樣，如絲氨酸蛋白酶、中性粒細胞彈性蛋白酶和組織蛋白酶 G，也可以在附近切割 GSDMD caspase-1/4裂解位點，釋放具有生物活性的 P30 N 末端區域。

雖然 caspase-8可以切割并激活 GSDMD 和 GSDME，從而導致焦亡[5]，而 caspase-3只能通過切割 GSDME 來導致焦亡，且 caspase-3-GSDME 途徑介導焦亡的主要途徑見于有關癌癥文獻報道中[3]， GSDME 也被確定為暴露于凋亡刺激后的二次壞死機制。這些焦亡途徑在中樞神經系統中活躍的細胞類型有待確定。

3 GSDMD的結構與功能

人類 GSDMD 含有242個氨基酸（amino acid， AA）N 末端結構域和199個 AA C 末端結構域[22]。 GSDMD 的兩個結構域是構成自身抑制機制的基礎，其中 C 末端結構域組成性地與 N 末端結構域相互作用并抑制 N 末端結構域。在被 caspase-1/4切割后， C 末端的自身抑制作用被去除，釋放形成孔的 P30N 末端片段。N-GSDMD 的實驗性過表達單是片段就足以激活焦亡[13]，在質膜上脂質結合觸發 N-GSDMD 寡聚形成跨膜孔。這些氣孔潛在性破壞了局部滲透壓，導致腫脹、膜破裂和溶解，迅速將細胞內容物釋放到細胞外環境。利用原子力和電子顯微鏡，很多課題組已經觀測到 GSDMD 裂解后數分鐘內 N 端就會形成膜孔[16]。決定 GSDMD 孔的形成因素是否會導致活細胞釋放細胞因子或致細胞焦亡目前仍在調查中。

4中樞神經系統細胞焦亡

在不同的中樞神經系統細胞群中，使用各種不同的免疫組化方法對炎癥小體激活和焦亡進行了評估。雖然并非所有類型的細胞都能合成促炎因子白細胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）和白細胞介素-18（interleukin-18， IL-18）[23]，但事實上所有類型的細胞暴露于促炎癥刺激物時，均會過度激活炎癥小體，在特定情況下發生焦亡。本文特別關注的是中樞神經系統腦巨噬細胞樣細胞（brain? macrophage-like cells，BMC）發生炎癥時的焦亡證據。

BMC 包括常駐的小膠質細胞、血管周圍細胞、脈絡叢細胞和腦膜巨噬細胞，這些細胞可以被神經炎癥高度誘導，在穩態條件下表達炎癥體成分。Nod 樣受體蛋白（Nod-like receptor pyrin? domain， NLRP）炎癥小體誘導的炎癥反應與神經變性疾病關系密切，其在缺血性腦卒中扮演的炎癥損傷角色也日益引起重視。在基線水平人類胚胎組織中的小膠質細胞，表達 NLRP1、凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like? protein containing CARD， ASC）、黑色素瘤缺乏因子2（absent inmelanoma 2， AIM2）和 caspase-1轉錄。而 NLRP3轉錄在暴露于啟動刺激時可被誘導，在人類胚胎小膠質細胞中可誘導 caspase-1裂解和 IL-1β成熟，以響應多種 NLRP3炎癥體激活刺激物。并且在人類小膠質細胞暴露于 NLRP3炎性體激活刺激物后的炎性體激活下游發現 GSDMD 依賴性焦亡。

5缺血性腦卒中的炎癥小體和焦亡

自從2002年發現炎癥小體以來，這一途徑一直被認為與神經系統發病機制有關。最近研究顯示，當發生缺血性腦卒中時，在缺血半暗帶的腦細胞焦亡的上游分子高表達，提示焦亡在腦缺血損傷發展中的重要作用。細胞焦亡時釋放大量胞內容物和促炎介質（如 IL-1β、IL-18等）[23]，誘導級聯放大的炎癥反應。細胞焦亡的信號途徑、關鍵分子靶標逐漸得到認識，正在成為缺血損傷研究的新熱點。2018年Pon等[24]研究發現，當缺血性中風激活小膠質細胞后， NLRP1、NLRP3、NLRC4和 AIM2炎性小體蛋白分子的表達增多、活化增強。用免疫印跡分析表明小膠質細胞在缺血條件下可釋放炎性小體和激活的促炎因子，而后介導炎癥反應和本身的焦亡。

炎癥小體成分（包括炎癥小體相關細胞因子、NLRP1、NLRC4、ASC和caspase-1/11）在多種缺血性腦損傷模型中具有保護作用，但并非所有研究都認為炎癥小體抑制具有保護作用1251。可能在早期（梗死后30min內）神經元 caspase-1和caspase-3 被激活，如caspase-1抑制劑Ac-YVAD-cmk可阻止體內 caspase—3的激活。血栓栓塞性卒中后，神經元和巨噬細胞和/或小膠質細胞對各種炎癥組分（包括NLRP1、ASC和caspase-1）均呈免疫陽性;缺血性中風后也檢測到NLRP2免疫陽性星形膠質細胞126]。局灶性腦缺血已被證明在缺血半暗帶區上調IL—1β和IL—18，下游小膠質細胞TREM—1受體和激酶SYK的表達增高，且伴隨GSDMD增加表達和裂解。正如所證明的，小膠質細胞和/或巨噬細胞特異性蛋白抗體（ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba-1）導致BMC特別容易發生細胞焦亡，通過Iba—1與GSDMD的共定位和透射電子顯微鏡證明在細胞質膜中存在GSDMD孔的分布。

6 小結

本文強調了GSDMD作為驅動因素的焦亡的關鍵進展，促炎癥細胞程序性死亡—焦亡和缺血性腦卒中的關系，以及在今后的研究中，必須著力解決的幾個重要問題。如促炎癥反應與缺血性腦卒中的細胞因子產生和焦亡，需要進一步研究GSDMD在細胞因子釋放和代謝中的功能，探索清楚這一具有挑戰性的細胞死亡方式。此外，中樞神經系統的獨特特性，包括長壽命、終末分化、更新能力低等，以及精細和復雜的組織結構，可能激發對炎癥刺激的獨特反應。目前的研究證據表明通過阻止細胞焦亡可減輕缺血性腦卒中的發生發展，通過靶向干預細胞焦亡有望使缺血性腦卒中在治療上取得新的突破，有望在未來成為阻斷缺血性腦卒中進展的有效治療方法，但目前的研究多以機制研究為主，且多在細胞和動物水平上進行，接下來可完善已有的研究成果，進一步加強細胞焦亡相關過程與缺血性腦卒中關系的臨床研究，為缺血性腦卒中的治療提供更有效的策略。

[參考文獻]

[1] Ketelut-Carneiro N，FitzgeraldKA.Apoptosis， Pyroptosis，and Necroptosis-Oh My！ The Many Ways a Cell Can Die[J].Journal of Molecular Biology，2021，434 （4）：167378.

[2]Nour S，Erekat.Apoptosis and its therapeutic implications in neurodegenerative diseases[J].Clinical Anatomy， 2022，35（1）：65-78.

[3] Wang Y，YinB，LiD，etal.GSDME mediates caspase- 3-dependent pyroptosis in gastric cancer[J].BiochemBiophys Res Commun，2018，495（1）：1418-1425.

[4] Jiang M，QiL，Li L， et al.The caspase-3/GSDME signal pathway as a switch between apoptosis and pyroptosis in cancer[J].Cell Death Discovery，2020，6（1）：112.

[5] OrningP，WengD，StarheimK，etal.Pathogen blockade of TAKI triggers caspase-8-dependent cleavage of gasdermin D and cell death[J].Science，2018，362 （6418）：1064-1069.

[6] Kemal U，Tufekci，BedirI，etal.Resveratrol Inhibits NLRP3 Inflammasome-Induced Pyroptosis and miR- 155 Expression in Microglia Through Sirtl/AMPK Pathway[J].Neurotoxicity Research，2021，39（6）： 1812-1829.

[7] Kohsuke，Tsuchiya.Inflammasome-associated cell death： Pyroptosis，apoptosis，and physiological implications[J]. Mierobiology and immunology，2020，64（4）：252-269. [8] Kathy，Triantafilou.Enigmatic inflammasomes[J]. Immunology，2021，162（3）：249-251.

[9] Franklin BS，LatzE，SchmidtFI.The intra-and extracellular functions of ASC specks[J].Immunol Rev， 2018，281（1）：74-87.

[10] Niu T， Charlotte， De Rosny， et al.NLRP3 phosphorylation in its LRR domain critically regulates inflammasome assembly[J].Nature Communications， 2021，12（1）：5862.

[11]Boucher D.Caspase-1 self-cleavage is an intrinsic mechanism to terminate inflammasome activity[J]J.Exp. Med，2018，215（3）：827-40

[12] Gu J，RauniyarS，WangY，etal.Chrysophanol Induced Glioma Cells Apoptosis via Activation of Mitochondrial Apoptosis Pathway[J].Bioengineered， 2021，12（1）：6855-6868.

[13] KayagakiN，StoweIB，LeeBL，et al.Caspase-11 cleaves gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling[J].Nature，2015，526（7575）：666-671.

[14] Shi J，ZhaoY，WangK，etal.Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death[J].Nature，2015，526（7575）：660-665.

[15] RühlS，BrozP.Regulation of lytic and non-lytic functions of gasdermin pores[J].Journal of Molecular Biology，2021，434（4）：167246.

[16] Ding J，Wang K，Liu W，et al.Pore-forming activityand structural autoinhibition of the gasdermin family[J]. Nature，2016，535（7610）：111-116.

[17] Wang C，RuanJ.Mechanistic insights into gasderminpore formation and regulation in pyroptosis[J].Journal of Molecular Biology，2022，434（4）：167297.

[18] Li L，Li Y，Bai Y.Role of GSDMB in Pyroptosis andCancer[J].Cancer Management and Research，2020，12：3033-3043.

[19] Zhang J，Chen Y，He Q.Distinct characteristics ofdasatinib-induced pyroptosis in gasdermin E-expressing human lung cancer A549 cells and neuroblastoma SH-SY5Y cells[J].Oncology Letters，2020，20（1）：145-154.

[20] Erivan S，Ramos-Junior，Ana Carolina， et al.Gasdermin：A new player to the inflammasome game[J].Biomedical Journal，2017，40（6）：313-316.

[21] Kayagaki N，Lee BL，Stowe Ia B，et al.IRF2transcriptionally induces GSDMD expression for pyroptosis[J].Sci Signal，2019，12（582）：e4917.

[22] Kovacs SB，Miao EA.Gasdermins： Effectors of Pyroptosis[J].Trends Cell Biol，2017，27（9）：673-684.

[23] Zhang D，Qian J，Zhang P，et al.Gasdermin D servesas a key executioner of pyroptosis in experimental cerebral ischemia and reperfusion model both in vivo and in vitro[J]. J Neurosci Res，2019，97（6）：645-660.

[24] Pon L，Kang SW，Baik SH，et al.Evidence thatNLRC4 inflammasome mediates apoptotic and pyroptotic microglial death following ischemic stroke[J].Brain BehavImmun，2018，75：34-47.

[25] Lemarchand E，Barrington J，Chenery A，et al.Extentof Ischemic Brain Injury After Thrombotic Stroke Is Independent of the NLRP3（NACHT， LRR and PYD Domains-Containing Protein 3） Inflammasome[J]. Stroke，2019，50（5）：1232-1239.

[26] Jiao Y，Wang J，Zhang H，et al.Inhibition ofmicroglial receptor-interacting protein kinase 1 ameliorates neuroinflammation following cerebral ischaemic stroke[J].Journal of Cellular and Molecular Medicine，2020，24（21）：12585-12598.

（收稿日期：2021-11-26）