葉酸和利拉魯肽對 2 型糖尿病血管內皮保護作用的相關性研究

劉雪鳳 譚麗艷

[摘要]目的通過檢測利拉魯肽和葉酸對2型糖尿病（T2DM）小鼠血漿 NO 和 ROS 的影響，探討兩者在糖尿病血管內皮保護的作用上是否存在協同作用。方法采用鏈脲佐菌素多次腹腔注射的方法制備2型糖尿病小鼠模型。將糖尿病小鼠隨機分為四組（葉酸組、利拉魯肽組、聯合組、空白組），每組各8只，根據分組情況分別給予葉酸溶液灌胃及利拉魯肽注射液腹腔注射干預8周（空白對照組給予生理鹽水灌胃及腹腔注射），采用斷頭取血法取小鼠外周血，采用 ELISA 法檢測小鼠血漿一氧化氮（NO）、活性氧（ROS）、空腹胰島素（FIN）的濃度。結果聯合組的血漿 NO、FIN 最高，其次利拉魯肽組和葉酸組，空白組最低，差異有統計學意義（P <0.05）。聯合組的血漿 ROS 最低，其次為葉酸組和利拉魯肽組，空白組最高，差異有統計學意義（P <0.05）。聯合組的血漿 FPG 最低，其次是利拉魯肽組和葉酸組，空白組最高，差異有統計學意義（P <0.05）。結論利拉魯肽和葉酸對2型糖尿病小鼠血管內皮的保護作用上存在協同作用。

[關鍵詞]2型糖尿病;利拉魯肽;葉酸;血管內皮;協同作用

[中圖分類號] R587.1? [文獻標識碼] A?? [文章編號]2095-0616（2022）08-0080-05

Study on the correlation of folic acid with liraglutide in protecting vascular endothelium in mice with T2DM

LIU? Xuefeng??? TAN? Liyan

Department of Endocrinology， the First Affiliated Hospital ofJiamusi University， Heilongjiang， Jiamusi 154000， China [Abstract] Objective To investigate the synergistic effect between liraglutide and folic acid in protecting vascular endothelium by examining the effect of liraglutide and folic acid on plasma nitric oxide （NO） and reactive oxygen species （ROS） of mice with type 2 diabetes mellitus （T2DM）. Methods A mouse model of T2DM was prepared by multiple intraperitoneal injections of streptozotocin. The mice with T2DM were randomly divided into four groups （the folic acid group， the liraglutide group， the combined group and the blank group）， with 8 mice in each group， and they were given by intragastric administration with folic acid solution and injected with liraglutide injection intraperitoneally for 8 weeks according to the grouping results （the blank group was given by intragastric administration and intraperitoneally injected with normal saline）. The peripheral blood of mice was collected by decapitation， and plasma NO， ROS and fasting insulin （FIN） concentrations were measured by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）. Results The plasma NO and FIN concentrations were the highest in the combined group， followed by the liraglutide and folic acid groups， and the lowest in the blank group， with statistically significant differences （P <0.05）. The plasma ROS concentration was the lowest in the combined group， followed by the folic acid and liraglutide groups， and the highest in the blank group， with statistically significant differences （P <0.05）. The plasma FPG concentration was the lowest in the combined group， followed by the folicacid and liraglutide groups， and the highest in the blank group， with statistically significant differences （P <0.05）. Conclusion There is a synergistic effect between liraglutide and folic acid in protecting vascular endothelium in mice with T2DM.

[Key words] Type 2 diabetes mellitus; Liraglutide; Folic acid; Vascular endothelium; Synergistic effect

糖尿病（diabetes mellitus， DM）是一組由多種病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝性疾病。2015—2017年中華醫學會內分泌學分會在全國31個省進行調查，發現我國18歲及以上年齡人群中糖尿病患病率達11.2%[1]。DM 有多種分型，以2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus， T2DM）最為常見，約占90%以上[2]。T2DM 隨著病情進展會出現多種并發癥，其中以血管并發癥最為常見，其患者約有70%～80%直接死于糖尿病大血管并發癥[3]。葉酸作為改善高同型半胱氨酸的藥物為人熟知，其具有血管內皮保護作用也得到了大眾的認可。利拉魯肽作為新型的降糖藥物，在降低心血管事件上具有積極的作用。目前研究發現兩者對糖尿病血管內皮均存在保護作用，并有部分相似作用機制，本實驗希望通過小鼠實驗探究上述兩藥聯合使用對糖尿病血管內皮保護作用上是否存在協同作用。

1資料與方法

1.1 一般資料

實驗材料及試劑：健康雄性8周齡昆明小鼠購于吉林省生物制品廠動物室（序號：202100036061）;小鼠血漿一氧化氮（nitric oxide， NO）酶聯反應試劑盒（ELISA 法）（上海博湖生物科技有限公司，產品號： PM103771）;血漿活性氧（reactive oxygen species， ROS）酶聯反應試劑盒（ELISA 法）（上海博湖生物科技有限公司，產品號：PM104209）;空腹胰島素（fasting serum insulin，FIN）酶聯反應試劑盒（ELISA 法）（上海博湖生物科技有限公司，產品號：PM154243）;血糖檢測儀及檢測試紙（江蘇魚躍醫療設備股份有限公司，型號：590血糖儀）;利拉魯肽注射液（丹麥諾和諾德制藥有限公司，國藥準字J20200026）;葉酸片（北京華潤紫竹藥業有限公司）。T2DM 模型小鼠的制備：取健康的8周齡昆明小鼠40只給予普通小鼠飼料適應性喂養2周，給予高脂飲食喂養8周，測小鼠體重（41.5±8.2）g，禁食不禁水12 h，連續2 d 腹腔注射 STZ 40 mg/kg，繼續高脂飲食飼養72 h，72 h 后禁食12 h，測定空腹血糖（FPG）， FPG ≥11.1 mmol/L 即為造模成功，最終造模成功 T2DM 小鼠32只，死亡8只。干預：將32只糖尿病小鼠隨機分為四組（葉酸組、利拉魯肽組、聯合組、空白組，每組各8只），四組小鼠均給予相同的高脂飲食及水，定時清理鼠籠，保證鼠籠清潔，葉酸組小鼠給予葉酸溶液（71μg/kg）灌胃，利拉魯肽組給予利拉魯肽溶液（0.2 mg/kg）腹腔注射，聯合組給予葉酸溶液（71μg/kg）灌胃及利拉魯肽溶液（0.2 mg/kg）腹腔注射，空白組給予生理鹽水灌胃（71μg/kg）及腹腔注射（0.2 mg/kg）。動物處理及取樣：四組小鼠藥物干預8周后禁食不禁水12 h，斷頭法取血置于 EP 管內，靜置20 min，后以2000 r/min 離心15 min，取上層澄清血漿，于-80℃冰箱內保存。

1.2 相關指標檢測

血漿 NO、ROS、FIN 的檢測：取小鼠血漿50μl，使用小鼠血漿 NO、ROS、FIN 酶聯反應試劑盒（ELISA 法）分別測得各組小鼠血漿 NO、ROS、FIN 的濃度，并在酶標儀在450 nm 波長處測定各孔吸光度值，利用標準曲線計算濃度，結果記錄于統計表格內。

血漿 FPG 的檢測：四組小鼠藥物干預8周后禁食不禁水12 h 后，采用斷尾取血法取適量小鼠鼠尾血，置于血糖試紙上，使用血糖儀測空腹血糖并記錄。

1.3 統計學方法

本研究使用 SPSS 23.0軟件包進行數據統計及分析，計量資料以均數±標準差（x ± s）表示，采用方差分析，采用 LSD-t 檢驗比較組間差異;采用 Pearson 相關性分析檢驗兩連續變量的相關性， P <0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 各組小鼠血漿NO、ROS、FIN、FPG濃度比較

小鼠血漿 NO、ROS、FIN、FPG 濃度分布均符合正態分布。各組小鼠血漿 NO、FIN 濃度，以聯合組最高，其次為利拉魯肽組和葉酸組，空白組最低，差異有統計學意義（P <0.05）;各組小鼠血漿 ROS 濃度，以聯合組最低，其次為葉酸組和利拉魯肽組，空白組最高，差異有統計學意義（P <0.05）;各組小鼠血漿 FPG，以聯合組最低，其次是利拉魯肽組和葉酸組，空白組最高，差異有統計學意義（P <0.05）。見表1。

2.2 小鼠血漿NO與FPG濃度的相關性

NO濃度與FPG濃度呈負相關（r=-0.825）（見圖1）， LSD-t 檢驗結果提示各組小鼠血漿 NO 濃度除葉酸組與利拉魯肽組外，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 小鼠血漿ROS與FPG濃度的相關性

血漿 ROS 濃度與空腹血糖濃度呈正相關（r=0.756）（圖2）， LSD-t 檢驗結果提示各組小鼠血漿 ROS 濃度除葉酸組與利拉魯肽組外，差異有統計學意義（P <0.05）。見表3。

2.4 小鼠血漿FIN與FPG的相關性

小鼠血漿 FIN 濃度與 FPG 濃度呈負相關（r=-0.927）（圖3），LSD-t 檢驗結果提示各組小鼠 FIN 血漿濃度比較，差異有統計學意義（P <0.05）。見表4。

3討論

血管內皮細胞是構成心血管封閉系統的形態基礎，其功能障礙則是血管內皮損害的主要表現形式，表現為內皮依賴的血管舒縮功能、屏障功能障礙及血管內皮炎性因子的附著或表達增加等[4]。血管內皮損害的兩個重要標志是 NO 的生物利用度的降低和 ROS 的生成增加。

慢性持續性高血糖是糖尿病患者最常見的表現。長期的高血糖會導致內皮素的升高，血管內皮內的 NO 下降，同時誘發 NO 合成酶（eNOS）蛋白及其 mRNA 表達異常，引起 NO 的合成減少及其生物活性降低，導致持續的血管內皮損傷[5];同時長期慢性的高糖環境，會誘發血管內皮的氧化應激，產生大量的 ROS，不僅會消耗血管內皮細胞內的還原型物質，還會加速血管內皮下的脂質氧化，造成血管的粥樣硬化，并繼發促凝和抗凝系統平衡紊亂，加重血管內皮功能損害[6]。除此之外，葉酸的缺乏也會對血管內皮造成持續的損害。一方面，它會引起血管內皮氧化應激反應的發生，促進血管內皮 ROS 的生成;另一方面，它引起的血管內皮內四氫生物蝶呤的利用度下降，誘發eNOS脫偶聯，引起血管內皮內 NO 生成進一步減少，造成血管內皮的持續損害[7]。

葉酸作為水溶性維生素 B，能促進內源性四氫生物蝶呤（BH4）的循環，使 BH4與eNOS的重新耦聯，恢復已解耦聯的eNOS的功能，增加血管內皮內 NO 的合成，達到對血管的保護作用[8]。而且葉酸能清除血管內皮細胞內羥自由基及超氧陰離子自由基，抑制血管內皮內氧化應激反應，改善血管內皮功能障礙[9]。其類似物四氫葉酸作為多種生物反應過程中的輔酶參與一碳單位的轉移，促進同型半胱氨酸再甲基化形成甲硫氨酸，增加血管內皮細胞蛋白質、磷脂等的合成;同時它具有抗氧化性，可以在線粒體電子傳遞鏈水平阻斷超氧化物的生成，發揮其對血管內皮的保護作用[10]。本研究發現給予葉酸干預的小鼠，其血漿 ROS 濃度較空白組降低，血漿 NO 濃度較空白組升高，說明葉酸對糖尿病血管存在保護作用。不僅如此，葉酸干預組小鼠 FIN 水平較空白組高，血漿 FPG 水平較空白組低，說明葉酸改善了糖尿病小鼠的胰島素抵抗，這可能是因為葉酸促進了血液中胰島素和細胞表面受體有效結合，并減少胰島素抵抗，提高胰島素受體的敏感性;另一方面葉酸可以抑制腸道黏膜吸收葡萄糖，從而降低外周血糖濃度[11]。盡管如此，葉酸降糖能力也低于利拉魯肽。

利拉魯肽通過激活 GLP-1受體，促進胰島β細胞產生葡萄糖依賴性的胰島素分泌，并抑制胰島α細胞分泌胰高血糖素，達到降糖效果，改善慢性高血糖對于血管內皮的損害[12];同時它能通過抑制血管內皮細胞中的纖溶酶原激活物抑制劑1型及血管黏附分子的表達，增加eN OS 的活性，增加血管內皮中的 NO 的表達，改善血管內皮功能[13]。不僅如此，利拉魯肽可以降低血漿中的三酰甘油、膽固醇濃度，減少血管內皮內脂質氧化，改善血管內皮的持續損害[14]。而張瑤等[15]的大鼠實驗發現腹腔注射利拉魯肽可以改善血管內皮細胞內質網應激及炎癥反應，同時抑制 p38 MAKA 通過，引起超氧化物歧化酶（SOD）及谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活性升高，表現出對血管的保護作用。本研究發現利拉魯肽干預的小鼠血漿 ROS 濃度較空白組降低，血漿 NO、FIN 濃度較空白組升高。說明利拉魯肽對糖尿病血管內皮保護作用是顯著的。

葉酸與利拉魯肽對于血管內皮保護作用上存在相似的機制，且兩者間未見相互藥物作用的不良反應，因此兩者聯合應用是符合用藥規定的，且兩者對于血管內皮保護的作用顯著。本研究結果支持這一點，葉酸聯合利拉魯肽干預的小鼠，其血漿 ROS、 FPG 濃度為四組中最低的，血漿 NO、FIN 為四組中最高，說明利拉魯肽和葉酸對2型糖尿病小鼠血管內皮的保護作用上存在協同作用。但是這一作用在糖尿病患者身上能否體現仍有待進一步驗證。

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（收稿日期：2021-10-09）