網絡藥理學對乳增寧膠囊治療乳腺增生作用機制研究

張好科　付兆媛　賈永翠

關鍵詞：網絡藥理學;乳增寧膠囊;乳腺增生;HE染色

中圖分類號：R285 文獻標志碼：A

乳腺增生[1]（Hyperplasia of mammary glands，HMG）是乳腺正常發(fā)育和退化過程失常導致的一種良性乳腺疾病，病變主要發(fā)生在乳腺導管和小葉。研究發(fā)現(xiàn)HMG 好發(fā)于25～45歲女性，其中大城市職業(yè)婦女占據(jù)50%～70%，并且本病極容易復發(fā)，癌變率為2%～4%[2-4]。2013年貴州省[5]進行女性乳腺疾病篩查，結果發(fā)現(xiàn)在38256人中患有HMG的達6075人，占良性乳腺疾病86. 28%，可見HMG是現(xiàn)代女性較常見的多發(fā)病之一，對女性的身心健康影響較大。HMG 病因尚不清楚，但研究發(fā)現(xiàn)下丘腦—垂體—卵巢—乳房內分泌軸平衡失調，特別是雌激素分泌增加、孕激素分泌減少是主要病因[4，6]。目前HMG 的治療主要以激素與手術治療為主，但是由于激素受體在機體廣泛分布的原因，使現(xiàn)代醫(yī)學治療手段存在較多副作用，所以促使尋找新的治療方法勢在必行。

中醫(yī)認為，HMG 歸屬于[7-8]“乳中結核”、“乳核”、“乳內硬腫”、“乳癖”等范疇，發(fā)病與肝、脾、腎的關系最為密切。中醫(yī)以整體觀念和辨證論治為指導思想，通過對機體的整體調節(jié)而發(fā)揮作用，從而發(fā)揮臨床療效。乳增寧膠囊由艾葉、淫羊藿、天冬、柴胡、川楝子、土貝母6 味中藥組成，主要功能疏肝理氣，活血化瘀，調理沖任。藥理研究發(fā)現(xiàn)[9]乳增寧膠囊的主要成分有淫羊藿苷、土貝母苷甲、土貝母苷乙、土貝母苷丙、棕矢車菊素、異澤蘭黃素、柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 等。研究發(fā)現(xiàn)[10]淫羊藿苷具有雌激素活性;土貝母苷甲具有顯著的抗腫瘤作用;柴胡皂苷- d[11]有可能抑制乳腺癌細胞增殖和轉移。臨床研究發(fā)現(xiàn)乳增寧膠囊對MHG具有顯著療效，并且不良反應少。然而乳增寧膠囊因其復雜化學系統(tǒng)和生物系統(tǒng)之間相互作用使其臨床應用受到限制。網絡藥理學方法[12]是揭示中藥復方多成分、多途徑、多靶點療效模式的重要方法，其與中醫(yī)的辨證論治思想不謀而合，為探索中藥復方的靶標提供了可能。因此本研究采用網絡藥理學探討乳增寧膠囊對HMG 的作用機制并結合動物實驗對其療效進行驗證。

1資料與方法

1.1網絡藥理學

1.1.1乳增寧膠囊藥物活性成分及靶點的篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫及分析平臺（Tradition?al Chinese Medicine Systems Pharmacology Database andAnalysis Plat- form，TCMSP）中逐此次輸入關鍵字艾葉、淫羊藿、天冬、柴胡、川楝子、土貝母檢索6 味中藥的活性成分，并以口服生物利用度（OB≥30%）與類藥性DL≥0.18 為篩查條件。采用篩選藥物活性成分的分子編碼，進行檢索藥物活性成分相關靶標。

1.1.2 HMG 疾病靶點的篩選

采用GeneCard數(shù)據(jù)庫檢索框輸入關鍵詞hyper?plasia of mammary glands 檢索HMG 相關靶點。

1.1.3藥物活性成分與疾病共同靶點的篩選及蛋白互作網絡構建

運用Perl語言篩選藥物活性成分與HMG 疾病的共同靶點，并繪制韋恩圖;在線采用STRING與Cyto?scape 3.7.2軟件制作共同靶點蛋白互作網絡（PPI），最低相互作用閾值設為“highest confidence”（>0. 7），“節(jié)點（node）”代表不同靶點，“邊（edge）”代表不同靶點之間的相互關系網絡。

1.1.4藥物活性成分與疾病靶點互作網絡構建

采用Cytoscape 3.7.2 軟件構建藥物活性成分與疾病靶點互作網絡，“節(jié)點（node）”代表不同疾病靶點、藥物活性成分，“邊（edge）”代表疾病靶點與藥物活性成分之間的相互作用關系。

1.1.5 GO分析與KEGG富集分析

采用R編程語言對藥物活性成分與疾病共同靶點進行GO分析與KEGG富集分析，并采用Cytoscape 3.7.2軟件對靶點集進行相關性計算，構建富集通路與靶點互作網絡，確定核心靶點，對核心靶點進行實驗驗證。

1.2動物實驗

1.2.1藥物及試劑準備

乳增寧膠囊（陜西健民制藥有限公司，規(guī)格：0.5mg×36粒，批準文號：國藥準字Z20044180，）購自生產批號Z10950011;他莫昔芬（揚子江藥業(yè)集團有限公司，規(guī)格：10mg×60片，批準文號：國藥準字H32021472）;雌性Wistar 大鼠（200±5g）（許可編號：SCXK-（A）2012-0004）購自甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物中心。

1.2.2造模與分組

動物在SPF 實驗室中飼養(yǎng)（飼養(yǎng)條件：12：12h，光照：黑暗;溫度：25±2 °C;濕度：50±10%）。適應后7d，將24 只Wistar大鼠隨機分為4 組（正常組、模型組、他莫昔芬組、乳增寧膠囊組），每組6 只。本研究采用依次腹腔注射雌激素（0.5mg /kg /d）25d，孕激素（5mg/kg /d）5d的方法建立HMG 動物模型[13]。模型組、陽性對照組、藥物干預組動物均采用上述造模方法建立HMG動物模型。藥物干預期間正常組和模型組接受與藥物組相同體積的生理鹽水灌胃;他莫昔芬組動物接受他莫昔芬4 mg / kg /d灌胃治療;乳增寧膠囊組動物接受乳增寧膠囊0.6 g/kg/d 灌胃給藥。

1.2.3病理組織切片

本研究采集所有大鼠左側第二個乳腺通過HE染色方法評價乳腺增生的程度及乳增寧膠囊的干預效果。HE染色切片的制作主要步驟如下：用10% 的馬林固定24h，轉移至70% 的乙醇中并石蠟包埋處理，組織切片厚度為4μm，用蘇木精/伊紅進行染色。

2結果

2.1乳增寧膠囊活性成分、靶點及HMG 靶點的篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)平臺共檢索到乳增寧膠囊生物活性成分81個、藥物作用相關靶點共1314個，經去重之后得到76個生物活性成分、242個作用靶點;在Gene?Card數(shù)據(jù)平臺以“score≥10為篩查條件”共檢索到HMG相關人類基因665個，然后采用Perl語言篩選出乳增寧膠囊與HMG共同靶點99個，并以韋恩圖的形式展示，如圖1，作用于疾病靶點的藥物活性成分有30個;并采用STRING+Cytoscape 3.7.2軟件構建共同靶點之間互作網絡關系（PPI），結果共得到99個節(jié)點、842條邊，如圖2。

2.2藥物活性成分與疾病靶點互作網絡關系構建

采用Cytoscape 3.7.2軟件構建藥物活性成分與疾病靶點互作網絡關系圖，共得到129個節(jié)點（30個藥物活性成分、99個疾病靶點）、272條邊，如圖3。

2.3 GO生物過程與KEGG信號通路富集分析

采用R編程語言對乳增寧膠囊有效成分與HMG的共同靶點進行GO與KEGG富集分析，得出GO富集分析前20 個相關靶點的生物學過程（BP）、細胞組分（CC）、分子功能（MF）富集，結果以氣泡圖形式呈現(xiàn)，如圖4、5、6。排名前5 的生物學過程分別是對金屬離子的反應（response to metal ion）、對類固醇激素的反應（response to steroid hormone）、對氧化應激的反應（re?sponse to oxidative stress）、對細胞氧化應激的反應（cel?lular response to oxidative stress）、對輻射的反應（re?sponse to radiation）。KEGG 富集分析得到前20個富集通路，主要有PI3K-Akt 信號通路（PI3K?Akt signalingpathway，PI3K/AKT）、卡波西氏肉瘤相關皰疹病毒感染（Kaposi sarcoma- associated herpesvirus infection，KSHV）、乙型肝炎（Hepatitis B，HB）、人巨細胞病毒感染（Human cytomegalovirus infection，HCMV）、癌癥中的蛋白多糖（Proteoglycans in cancer）等，結果以氣泡圖形式呈現(xiàn)，如圖7;并將富集通路與蛋白結果導入Cyto?scape 3.7.2軟件繪制富集通路與蛋白關系網絡，結果發(fā)現(xiàn)主要核心蛋白有絲裂原激活的蛋白激酶1（MAPK1），PKB蛋白激酶1（AKT1）和細胞周期蛋白（CCND1）等，如圖8。

2.4HE染色

HE染色鏡下見，空白組大鼠乳腺導管走形規(guī)則，管壁光滑，管腔內未見異常分泌物堵塞，導管上皮細胞排列均勻、無水腫，乳腺小葉分裂較少，腺泡數(shù)目少且體積較小;模型組大鼠乳腺導管明顯增多并擴張，管壁粗糙、增生，管腔內可見異常分泌物增多，導管上皮細胞排列紊亂、水腫明顯、呈多層分布，腺泡體積增大、數(shù)目增多，乳腺小葉分裂明顯，呈現(xiàn)出典型的乳腺增生病理改變;陽性對照組乳腺導管走形基本規(guī)則，管壁較為光滑，管腔內可見少許異常分泌物堆積，導管上皮細胞排列較均勻、無水腫，基本呈現(xiàn)單層分布，乳腺小葉分裂不明顯，腺泡數(shù)目及體積與正常組相當;乳增寧膠囊組腺泡上皮呈分泌狀，被覆單層立方或扁平上皮，排列略紊亂，導管輕度擴張，管壁較為光滑，腔內少許分泌物，腺泡體積與模型組相比明顯縮小、數(shù)目與正常組相當，如圖9。

3討論

近年HMG[14]發(fā)生率越開越高，現(xiàn)代醫(yī)學認為本病發(fā)病與內分泌的失調，特別是與雌孕激素比例失調相關，但是總體而言，HMG發(fā)病機制尚不清楚，故對乳腺增生的治療也是一個棘手問題。中醫(yī)學認為乳腺增生的主要病因病機在肝郁脾虛與沖任不調兩方面。肝主疏泄，性喜調達而惡抑郁，情志不遂，憂郁憤怒，則肝氣郁結，氣機阻滯，氣滯則血瘀;脾主運化，脾氣健則運化強，脾失健運則水濕失運，痰濁內生，血瘀與痰濁凝結于乳房而發(fā);腎主生長發(fā)育、沖脈為氣血之海、任主胞胎，生育、流產等傷及沖任，則肝血不足，氣血凝滯，日久而發(fā)[15-18]。臨床研究[19-21]發(fā)現(xiàn)乳增寧膠囊對乳腺增生具有顯著的改善作用。本研究采用網絡藥理學方法在乳增寧膠囊與HMG的“藥物有效成分-疾病靶點網絡關系”發(fā)現(xiàn)二者具有潛在的相關性，主要活性成分有β-谷固醇、豆甾醇、槲皮素、山萘酚、乙酸亞油酯等。通過GO分析發(fā)現(xiàn)乳增寧膠囊通過調控乳腺增生對金屬離子、類固醇激素、氧化應激、細胞氧化應激、輻射的反應等生物學過程，發(fā)揮抗乳腺增生的效應，同時在氧化應激反應的生物學過程中參與的多大30 個，可見氧化應激在HMG的發(fā)生發(fā)展過程中具有重大作用。

通過KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)乳增寧膠囊抗乳腺增生作用的通路主要包括PI3K/AKT、KSHV、HB、HCMV、癌癥中的蛋白多糖等信號通路，并且在PI3K/AKT信號通路富集的蛋白多達30個。研究發(fā)現(xiàn)[22] PI3K/AKT信號通路可被多種有絲分裂刺激信號活化，最終在癌變過程中扮演重要角色;HCMV 參與細胞周期的調節(jié)，能引起DNA 突變、抑制免疫應答和腫瘤抑制性蛋白的功能，并且許多證據(jù)表明HCMV與乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展有潛在聯(lián)系;本研究通過KEGG 富集分析結果通路與蛋白互作關系發(fā)現(xiàn)主要核心蛋白包括MAPK1、AKT1、CCND1 等[23-24]。MAPK1在乳腺癌患者中呈現(xiàn)高表達，通過下調MAPK1 的表達可調控人乳腺癌MCF-7 細胞增殖和凋亡;AKT1對乳腺癌細胞遷移具有負性調控的作用[25-26];CCND1在良性乳腺疾病及乳腺癌中呈現(xiàn)高表達，在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用[27]。通過HE染色方法對乳腺組織增生情況進行評價，發(fā)現(xiàn)乳增寧膠囊組動物乳腺組織增生明顯抑制，提示乳增寧膠囊治療乳腺增生有明顯作用。

乳增寧膠囊可能通過調控氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡等途徑從而明顯抑制乳腺組織增生，本研究為揭示乳增寧膠囊臨床治療HMG的分子機制提供了重要參考依據(jù)。