超高效液相色譜法快速測定飲料中赤蘚紅含量

謝 賽

(北京市東城區疾病預防控制中心，北京 100009)

為使食品保持或增加色澤，增進食欲，吸引消費者目光，生產廠家往往向食品中添加一些天然色素或合成色素。合成色素是以苯、甲苯、萘等化工產品為原料，經過磺化、硝化、鹵化、偶氮化等有機反應制成[1]。合成色素具有價格低廉、穩定性好、不易褪色等優點，被廣泛應用于食品加工行業中，但合成色素有一定毒性，過多食用會危害人體健康，甚至產生致癌性和致突變性等危害[2]。

赤蘚紅(Erythrosine，E127)呈紅色或紅褐色，為非偶氮類人工合成著色劑，相較于大多數偶氮類合成色素，其具有化學結構和性質上的差異[3]。國際食品法典委員會(CAC)、歐盟、美國、中國、日本和韓國等都允許在飲料中使用赤蘚紅[4]。其檢測方法有液相色譜法[5]、表面增強拉曼光譜法[6]、免疫PCR法[7]、示波極譜法[8]等，其中有關高效液相色譜法(HPLC)測定赤蘚紅的研究較多[9-12]，但是樣品的檢測時間較長，除去前處理時間，每件樣品上機測定時間約需30 min，且有機試劑消耗量較大。表面增強拉曼光譜法適用于現場快速檢測但檢出限較高，免疫PCR法的回收率范圍較寬，示波極譜法為早期研究方法但目前研究較少。超高效液相色譜(UPLC)是傳統高效液相色譜技術的升級和提高，與傳統的高效液相色譜相比具有分離度好、檢測速度快和靈敏度高等優點，可以有效縮減檢測時間與節省試劑用量，高效和環保優勢明顯[13]。

在色素前處理方法中，目前有關含赤蘚紅樣品的前處理方法有液—液萃取法[14]和固相萃取法[15-16]。GB 5009.35—2016對含赤蘚紅樣品單獨標明了液—液萃取法的前處理方法，其提取步驟多、試劑多，操作繁瑣，且加標回收也有較大損失，不適合大批量樣品的處理[11]。研究擬探求飲料樣品中赤蘚紅色素的簡便前處理方法，并采用超高效液相色譜法(UPLC)縮短儀器檢測時間，提高分離度、靈敏度，建立快速測定飲料中赤蘚紅色素的方法，旨在為飲料中赤蘚紅色素的大批量準確檢測提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

超高效液相色譜儀：H-Class型，美國Waters公司；

超純水處理儀：Milli-Q型，法國Millipore公司；

電子天平：MCE225S型，德國Sartorius公司；

pH計：PH211型，意大利Hanna公司。

1.1.2 試劑

甲醇、乙腈：色譜級，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；

乙酸銨：分析級，國藥集團化學試劑有限公司；

乙酸、氨水：色譜級，美國Sigma-Aldrich公司；

赤蘚紅標準溶液：GBW(E)100191-19002，103 μg/mL，中國計量科學研究院。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，柱溫40 ℃，流速0.3 mL/min，進樣量5 μL，二極管陣列檢測器，檢測波長530 nm，流動相為乙腈—乙酸銨(0.02 mol/L，pH 6.25)，以保留時間和光譜圖定性，以峰面積定量。

1.2.2 標準系列配制 分別準確吸取質量濃度為103 μg/mL 的赤蘚紅標準溶液0.10，0.20，0.30，0.40，0.50 mL，至5個10 mL潔凈容量瓶中，用超純水定容得到赤蘚紅標準溶液，質量濃度分別為1.03，2.06，3.09，4.12，5.15 mg/L系列標準工作溶液。

1.2.3 樣品前處理 移取適量飲料樣品，加入氨水調節pH值至7.00，以5%乙腈溶液定容，超聲提取30 min，經0.20 μm濾膜過濾，供超高效液相色譜儀測定。

1.2.4 檢測波長的選擇 將2.06 mg/L赤蘚紅標準溶液通過二極管陣列檢測器在210～800 nm范圍內進行全波長掃描。

1.2.5 流動相的選擇 調整流動相極性，有助于促進化合物在色譜柱中的吸附洗脫能力強弱，同時改善峰形。原先使用甲醇和0.02 mol/L乙酸銨溶液作為流動相，但是赤蘚紅色譜峰響應較低，峰形較寬，出峰時間較晚。采用乙腈和0.02 mol/L乙酸銨溶液作為流動相，以冰乙酸調節乙酸銨溶液pH為6.25。

1.2.6 洗脫梯度 梯度條件見表1。

表1 流動相梯度洗脫條件Table 1 Mobile phase gradient elution conditions

1.2.7 標準曲線繪制 取標準曲線工作溶液進行測定，進樣量為5 μL。赤蘚紅標準溶液質量濃度分別為1.03，2.06，3.09，4.12，5.15 mg/L，以色譜峰的峰面積(y)為縱坐標，以赤蘚紅含量(x)為橫坐標，繪制赤蘚紅的標準曲線圖。

1.2.8 數據處理 使用Excel錄入檢測結果，繪制統計圖表；應用配對t檢驗(雙尾)比較方法差異，以P<0.05表示具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 檢測波長的選擇

由圖1可知，當檢測波長為530 nm時，響應值出現最大值為0.07 AU，因此選擇530 nm作為赤蘚紅的檢測波長，與劉亞梅等[17]的結果一致。

圖1 赤蘚紅光譜圖Figure 1 Spectrogram of erythrosine

2.2 流動相的選擇

由圖2可知，赤蘚紅標準溶液的一針進樣檢測時間為8 min，赤蘚紅出峰時間適宜，保留時間為4.371 min，色譜峰形對稱，基線平穩，適用于檢測分析。

圖2 赤蘚紅標準溶液色譜圖Figure 2 Chromatograms of standard solutions of erythrosine

2.3 標準曲線與檢出限

由圖3可知，赤蘚紅標準曲線一階線性回歸方程為y=69.072×103x+12.61×103，相關回歸系數R2=0.999 5，結果表明在1.03～5.15 mg/L范圍內二者線性關系良好。方法定性檢出限(LOD)為0.010 3 mg/L，定量檢出限(LOQ)為0.030 9 mg/L。

圖3 赤蘚紅標準曲線Figure 3 Standard curve of erythrosine

2.4 樣品超聲提取時間的選擇

取市售無赤蘚紅的飲料樣品(經FAPAS檢測認證的陰性樣品)，加入赤蘚紅標準物質，用純水溶解定容檢測，樣品中加標赤蘚紅不能檢出。這是因為用純水溶解時，赤蘚紅色素易吸附于管壁，加入一定比例的有機相乙腈后很容易將赤蘚紅溶解下來，且乙腈也是流動相的一部分，適宜作溶劑。而且上機前采用的注射式過濾器避免使用尼龍濾膜，因為其化學成分為聚酰胺，會吸附赤蘚紅而造成損失。

試驗發現，加標樣品中加入微量氨水(pH值5.56)，5%乙腈水溶液溶解，可檢測到赤蘚紅的加標回收，但回收率較低。由圖4可知，隨著超聲時間的延長，赤蘚紅加標回收率先上升后緩慢下降再急速下降，當超聲提取時間為30 min時，回收率達到最大值62%。因此，確定樣品超聲提取的最適時間為30 min。

圖4 超聲提取時間對赤蘚紅加標回收率的影響Figure 4 Effect of ultrasonic extraction time on the spiked recovery of erythrosine

2.5 樣品pH值的選擇

由圖5可知，隨著樣液pH值的增加，赤蘚紅加標回收率顯著增大；當樣品pH值為7.00時，加標回收率達到100.7%，之后加標回收率趨于平緩；當氨水調節樣品pH至堿性(8.00，9.00)時，加標回收率略增，然而由于飲料由酸性變堿性，樣品顏色發生較大改變(由綠色變為藍色)，可能是由于pH值的變化造成了飲料中其他成分或色素色調的變化。最終確定樣品pH值以氨水調至7.00為宜。

圖5 樣品pH值對加標回收率的影響Figure 5 Effect of pH of sample on the spike recovery

2.6 回收率和精密度

由表2可知，試驗精密度為0.4%～3.2%，回收率為92%～109%。

表2 精密度和回收率測定結果Table 2 Results of precision and recovery

2.7 樣品分析

應用試驗建立的赤蘚紅含量測定方法對市售的6份飲料進行測定發現，網購的1份飲料樣品中含有赤蘚紅(圖6)，含量為0.034 6 g/kg，未超過GB 2760-2014規定的限量值(0.05 g/kg)，其他飲料未檢出。同時采用GB 5009.35—2016進行檢測，以配對t檢驗(雙尾)法比較，結果表明兩種方法無統計學差異。

圖6 市售飲料中赤蘚紅實測色譜圖Figure 6 Chromatogram of erythrosine in a commercially available beverage

3 結論

優化了飲料中合成著色劑赤蘚紅色素的前處理方法，建立了快速測定赤蘚紅含量的超高效液相色譜法。結果表明，飲料樣品經氨水調節pH至7.00，以5%乙腈水溶液定容，再超聲提取30 min后，過0.2 μm濾膜，可直接經UPLC進行測定，赤蘚紅標準曲線相關系數>0.999，加標回收率為92%～109%，RSD<3.2%，定性檢出限為0.01 mg/L，定量檢出限為0.03 mg/L。該方法準確性高、靈敏度高、重現性好。解決了國家標準中赤蘚紅色素需要經過液—液萃取前處理方法復雜的問題，并且不使用固相萃取柱，最大程度地簡化了樣品提取步驟，省時省力，提高了加標回收率，便于大批量飲料樣品中赤蘚紅的處理檢測，適用于食品安全法用于日常市場監督檢測。后續將使用超高效液相色譜法研究飲料中多種食品合成著色劑同時測定的檢測方法，以及對于復雜樣品基質中赤蘚紅色素前處理方法的適用性研究。