雞內金酶解物制備工藝優化及抗氧化活性研究

張慧瑩 楊為喬 陳 瑤 黎 攀,2 杜 冰,2

(1. 華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642；2. 嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室，廣東 廣州 510642)

雞內金為雉科動物家雞(Gallus gallus domesticus Brisson)的干燥沙囊內壁，始載于《神農本草經》，表述為上品丹雄雞項下[1]，于2002年被國家衛生計生委收錄于“既是食品又是藥品的物品名單”的藥食同源名單中[2]，具有降血脂[3-4]、保護心臟[5]、健胃消食[6]、增強腸道屏障功能[7]等功效。近年來，有關生物酶解制取多肽的研究越來越多，其效率高、污染低，而且酶解產物包含許多人體必需氨基酸。另一方面，通過酶解可以得到具有抗氧化活性、緩解疲勞和降血壓等功能性的更利于人體吸收的小分子多肽[8-9]。但目前有關雞內金酶解及酶解產物的研究較少[10]。研究擬利用中性蛋白酶及堿性蛋白酶對雞內金進行酶解，探究雞內金的最佳酶解工藝和酶解物的相對分子質量分布、氨基酸組成和抗氧化活性，以期為雞內金的進一步開發利用及雞內金多肽的分離純化與功能開發等提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

干雞內金：市售；

氫氧化鈉、五水合硫酸銅、四水合酒石酸鉀鈉、甲醛、二水合5-磺基水楊酸：分析純，廣州化學試劑廠；

三氯乙酸：分析純，上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

杜馬斯快速定氮分析儀：rapid N exceed型，德國元素Elementar公司；

全自動氨基酸分析儀：S-433D型，賽卡姆公司；

全自動氨基酸分析儀：日立L-8900型，日立高新技術公司；

筆式酸度計：PHB-3型，上海悅豐儀器儀表有限公司；

磁力攪拌器：85-2WS型，上海滬析實業有限公司；

數顯恒溫循環水箱：HH-420型，上海力辰邦西儀器科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 雞內金基本成分分析

(1) 粗多糖含量：按SN/T 4260—2015執行。

(2) 粗脂肪含量：按GB 5009.6—2016執行。

(3) 蛋白質含量：按GB 5009.5—2016執行。

1.2.2 單因素試驗 將干燥雞內金粉碎過60目篩，稱取一定量的雞內金粉末，以中性蛋白酶添加量為0.5%和堿性蛋白酶添加量為1.5%作為單因素試驗的基礎條件，分別對酶解pH、酶解溫度、酶解時間和蒸煮時間進行單因素試驗分析，以雞內金多肽得率及水解度(以干重計)為衡量指標。

(1) 蒸煮時間：固定酶解pH為8，酶解溫度50 ℃，酶解時間3 h，100 ℃滅酶10 min，考察蒸煮時間(2，3，4，5，6 h)對酶解上清液水解度和多肽得率的影響。

(2) 酶解pH：固定蒸煮時間4 h，酶解溫度50 ℃，酶解時間6 h，100 ℃滅酶10 min，考察酶解pH(7，8，9，10，11)對酶解上清液水解度和多肽得率的影響。

(3) 酶解時間：固定蒸煮時間4 h，酶解pH為8，酶解溫度50 ℃，100 ℃滅酶10 min，考察酶解時間(5，6，7，8，9 h)對酶解上清液水解度和多肽得率的影響。

(4) 酶解溫度：固定蒸煮時間4 h，酶解pH為8，酶解時間6 h，100 ℃滅酶10 min，考察酶解溫度(45，50，55，60，65 ℃)對酶解上清液水解度和多肽得率的影響。

1.2.3 正交試驗 根據單因素試驗結果，以水解度及多肽得率為衡量指標，選取酶解溫度、酶解時間、酶解pH值和蒸煮時間為影響因素，采用L9(34)正交試驗進行酶解試驗。

1.2.4 水解度測定 參照馮倩等[8]的方法并修改。先測定雞內金總氮含量；再測定酶解液中游離氨基酸態氮(CN)含量，并按式(1)計算水解度。

DH=CN×V/N×100%，

(1)

式中：

DH——水解度，%；

CN——酶解液中游離氨基酸態氮含量，g/mL；

N——總氮含量，g；

V——酶解液總體積，mL。

1.2.5 多肽含量測定 參照馮倩等[8]的方法。

1.2.6 氨基酸組成分析

(1) 水解氨基酸：參照GB 5009.124—2016并修改。準確稱取0.050 0 g雞內金粉末及0.030 0 g雞內金酶解物，分別加入10 mL鹽酸溶液(6 mol/L)，充入氮氣，110 ℃ 電熱鼓風恒溫箱中水解23 h，過濾，取1 mL濾液，56 ℃水浴蒸干，再加入1 mL一級水，蒸干，重復兩次。徹底蒸干后加入4 mL檸檬酸鈉緩沖溶液(pH 2.2)，振蕩混勻，過0.22 μm濾膜，進樣進行氨基酸自動分析儀分析。

(2) 游離氨基酸：準確稱取1 g雞內金粉末，加入3 mL 5%磺基水楊酸研磨30 min，靜置2 h，離心，上清液過0.22 μm濾膜，進樣進行氨基酸自動分析儀分析。

1.2.7 多肽相對分子質量分布測定 參照朱翰林等[11]的方法。色譜柱為TOSOH TSKgel G2000SWXL凝膠柱，流動相為乙腈—水溶液(V水∶V乙腈=80∶20，內含0.1% 的三氟乙酸)，流速0.5 mL/min，進樣量5 μL(質量濃度1 g/L)，檢測器為紫外檢測器，檢測波長220 nm。

1.2.8 多肽抗氧化性測定 按GB/T 39100—2020執行。

1.2.9 數據處理 采用 SPSS 17.0 軟件對數據進行統計分析，P<0.05認為具有顯著差異。

2 結果與分析

2.1 基本成分

由表1可知，雞內金營養成分組成絕大部分為蛋白質，其含量(干基)高達97.54%，多糖、脂肪等營養成分含量低，除雜工序簡單，且雞內金作為一種畜產品加工的副產品，具有便宜易得的特點，是一種理想的酶解原料。基于經濟效益和時間考慮，采用無需預先進行脫脂、脫糖處理，直接進行酶解的試驗方法。

表1 雞內金的基本成分Table 1 Basic composition of galli gigerii endothelium corneum %

2.2 單因素試驗

2.2.1 蒸煮時間對水解度及多肽得率的影響 由圖1可知，隨著蒸煮時間的延長，雞內金水解度逐漸增大，雞內金多肽得率則先增大后趨于平穩。這是因為酶解前進行高溫蒸煮會破壞雞內金的蛋白質結構，使得更多酶作用位點暴露出來，有利于蛋白質肽鍵的斷裂和酶解反應的進行，在一定范圍內，適當延長蒸煮時間有利于提高水解度和多肽得率，當水解度和多肽得率達到最大值時，由于底物有限，水解度和多肽得率便不再增加[12]。綜合分析，選擇蒸煮時間4，5，6 h作為正交試驗的3個水平。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖1 蒸煮時間對水解度及多肽得率的影響Figure 1 Effect of cooking time on degree of hydrolysis and peptide yield

2.2.2 酶解pH對水解度及多肽得率的影響 由圖2可知，隨著pH值的增大，雞內金水解度先增加后趨于平穩，多肽得率先增加后降低。當酶解pH值為10時，多肽得率最高為61.27%。多肽得率降低可能是因為在酶解pH值>10時，將大分子蛋白酶解為由3個或3個以上氨基酸組成的多肽的酶在非最適pH值環境下活性減弱[8]。綜合考慮，選擇酶解pH值為9，10，11作為正交試驗的3個水平。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖2 酶解pH值對水解度及多肽得率的影響Figure 2 Effect of the pH value of enzymatic hydrolysis on degree of hydrolysis and peptide yield

2.2.3 酶解時間對水解度及多肽得率的影響 由圖3可知，隨著酶解時間的延長，雞內金水解度先增加后趨于平穩，多肽得率先增加后下降，當酶解時間為8 h時，多肽得率最高。當酶解時間>8 h時，多肽得率開始下降，可能是因為酶解時間過長，多肽被進一步酶解成二肽或少部分的游離氨基酸[13-14]，無法被雙縮脲法檢測出來。綜合考慮，采用酶解時間7，8，9 h作為正交試驗的3個水平。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖3 酶解時間對水解度及多肽得率的影響Figure 3 Effect of enzymatic hydrolysis time on degree of hydrolysis and peptide yield

2.2.4 酶解溫度對水解度及多肽得率的影響 由圖4可知，隨著酶解溫度的增加，雞內金水解度和多肽得率均先增加后降低。當酶解溫度為55 ℃時，水解度達到最高為10.67%，當酶解溫度為60 ℃時，多肽得率達到最高為55.95%。酶的催化活性受酶解溫度影響較大，當雞內金酶解溫度超出其最適反應溫度范圍，酶活性小，酶解程度低，水解度和多肽得率低[11, 15]。綜合考慮，采用酶解溫度55，60，65 ℃作為正交試驗的3個水平。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖4 酶解溫度對水解度及多肽得率的影響Figure 4 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on degree of hydrolysis and peptide yield

2.3 正交試驗

在單因素試驗基礎上，選擇酶解溫度、酶解時間、酶解pH值和蒸煮時間為影響因素，以多肽得率和水解度為響應值，采用L9(34)正交試驗對雞內金酶解工藝進行優化，正交試驗因素水平表見表2，試驗設計及結果見表3。

表2 正交試驗因素水平表Table 2 The factor level of orthogonal experiment

表3 正交試驗設計與結果分析Table 3 Orthogonal experimental design and result analysis

由表3可知，各因素對雞內金多肽得率影響大小為酶解pH值>酶解時間>蒸煮時間>酶解溫度，理論最優雞內金酶解工藝組合為A2B3C3D3；各因素對雞內金水解度影響大小為酶解pH值>蒸煮時間>酶解時間>酶解溫度，理論最優雞內金酶解工藝組合為A2B1C3D3及A2B3C3D3。從多肽得率和水解度兩方面綜合考慮，確定A2B3C3D3為最優雞內金酶解工藝，即酶解溫度60 ℃，酶解時間9 h，酶解pH值11，蒸煮時間6 h。該條件下進行驗證實驗(n=3)，得到雞內金多肽得率為75.68%，水解度為14.43%。

2.4 雞內金及其酶解物氨基酸組成分析

由表4可知，雞內金酶解后，大部分氨基酸含量略微減少，是因為在堿性條件下進行酶解，除色氨酸外，絕大部分氨基酸都會受到不同程度的破壞。但雞內金與雞內金酶解物的17種氨基酸及不同呈味特征氨基酸的占比相差無幾，含量最豐富的5種氨基酸均為谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、精氨酸(Arg)、亮氨酸(Leu)和纈氨酸(Val)，與李澤鴻等[16]的結果較為相似，說明堿性蛋白酶與中性蛋白酶共同酶解較好地保留了雞內金的氨基酸多樣性。雞內金與雞內金酶解物的必需氨基酸(EAA)與非必需氨基酸(NEAA)的比值(EAA/NEAA)分別為57.02%，58.56%，均高于FAO/WHO的比值(40%)[8]，說明雞內金和雞內金酶解物含有較高的營養價值。

表4 氨基酸組成分析Table 4 Analysis of amino acid composition

由表5可知，甲硫氨酸RC值最低，RC值>1表示該氨基酸相對過剩，RC值<1表示該氨基酸相對不足，RC值最小的氨基酸為限制氨基酸，故甲硫氨酸為二者的限制性氨基酸[17]。

表5 各種必需氨基酸的氨基酸比值(RAA)、比值系數(RC)及比值系數分(SRC)Table 5 RAA, RC and SRC of human essential amino acids

2.5 雞內金酶解物相對分子質量分布

由圖5和表6可知，雞內金酶解物的數均分子量為108.50 Da，重均分子量為376.63 Da，峰位分子量為103.95 Da，平均分子量為1 057.4 Da。其中，相對分子質量<1 000 Da的酶解物所占比例為90.2%，相對分子質量為1 000～2 000 Da的酶解物所占比例為7.9%，相對分子質量為2 000～5 000 Da的酶解物所占比例為1.9%。說明酶解后，絕大部分難溶的大分子雞內金蛋白被酶解成易溶于水的小分子多肽，更加有利于消化吸收[18]。

圖5 雞內金酶解物分子量分布圖Figure 5 Molecular weight distribution diagram of enzymatic hydrolysate of galli gigerii endothelium corneum

2.6 雞內金酶解物的抗氧化性

2.6.1 對DPPH自由基的清除能力 由圖6可知，在0～10 mg/mL的質量濃度范圍內，隨著雞內金酶解物質量濃度的提高，DPPH自由基清除率也隨之提高。與谷胱甘肽相比，雞內金酶解物的DPPH自由基清除效果較差，但與南極磷蝦多肽[19]和烏賊墨多肽[20]的效果相當，說明雞內金酶解物仍具有一定的抗氧化活性，能在一定程度上減輕機體的氧化損傷。

圖6 雞內金酶解物對DPPH自由基的清除能力Figure 6 Scavenging ability of enzymatic hydrolysis products of galli gigerii endothelium corneum on DPPH free radicals

2.6.2 對ABTS+自由基的清除能力 由圖7可知，在0～10 mg/mL的質量濃度范圍內，隨著雞內金酶解物質量濃度的提高，ABTS+自由基清除率也隨之提高，且在1.5 mg/mL 質量濃度時，雞內金酶解物對ABTS+自由基的清除率達(94.19±0.26)%，與谷胱甘肽的最大清除率相近，且與南極磷蝦多肽[19]和烏賊墨多肽[20]相比，雞內金酶解物具有較強的ABTS+自由基清除能力，說明雞內金酶解物可能是多肽類抗氧化劑的良好來源。

圖7 雞內金酶解物對ABTS+自由基的清除能力Figure 7 Scavenging ability of enzymatic hydrolysis products of galli gigerii endothelium corneum on ABTS+ free radicals

3 結論

試驗表明，雞內金的最佳酶解工藝條件為利用中性蛋白酶和堿性蛋白酶共同酶解，酶解溫度60 ℃，酶解時間9 h，酶解pH值11，蒸煮時間6 h，此條件下雞內金多肽得率為75.68%，水解度為14.43%；該酶解工藝較好地保留了雞內金氨基酸的多樣性和營養價值，氨基酸組成與酶解前相差無幾，相對分子質量<1 000 Da的酶解物所占比例為90.2%，使得雞內金更易被人體消化吸收利用；此外，采用該工藝制備的雞內金酶解物還具有一定的抗氧化活性。后續可分析酶解物中具體類別的多肽、單一多肽的提純及特異生理功能。