基于分子對接探究紫蘇粗提物對代謝綜合征相關酶的抑制作用

余雨婷 張 彥 張 迎 李娜娜 程 研 鄭夢迪 閆 平 柴希艷

(1. 西安醫學院，陜西 西安 710021；2. 南京中醫藥大學，江蘇 南京 210023；3. 西安雨潤百德健康管理有限公司，陜西 西安 710061)

紫蘇(PerillafrutescensL. Britt.)為唇形科紫蘇屬植物?！吨袊幍洹?2020版)記載，紫蘇可用于風寒感冒、咳嗽嘔惡、妊娠嘔吐、魚蟹中毒等[1]。其含有揮發油、黃酮、酚酸、花色苷等化學成分，具有抗炎、抗氧化、抑菌、抗抑郁等作用[2]。

以肥胖、高血糖、高尿酸血癥等為主的代謝綜合征(MS)是多種代謝紊亂在體內“聚集”的一種病理狀態，可增加糖尿病、心血管疾病等的發生風險，近年來已成為全球公共健康問題[3]。目前對MS的治療均為對某一疾病的單一治療，如降低血糖、血脂、血壓水平[4]，尚缺少對MS的綜合治療。有效防治MS涉及多靶點調控[5-6]。胰脂肪酶是胰腺腺泡細胞分泌的消化脂肪的關鍵酶，抑制胰脂肪酶可降低腸道中脂肪的消化和分解，治療肥胖[7]。黃嘌呤氧化酶(XOD)是尿酸生成的關鍵酶，在體內可催化次黃嘌呤氧化為黃嘌呤，進一步氧化為尿酸[8-9]。該途徑可切斷尿酸生成，從而降低尿酸水平。α-淀粉酶是重要的碳水化合物水解酶，尤其對于中國2型糖尿病以碳水化合物為主要食物的患者，抑制α-淀粉酶的活性可減少餐后高血糖[10]。乙酰膽堿酯酶(AChE)是生物神經傳導中的關鍵性酶，AChE抑制劑(AChEI)是當前阿爾茨海默癥與中老年人癡呆最常見的疾病靶點[11]。

目前對紫蘇的研究多集中于紫蘇葉、紫蘇籽粕[12]及紫蘇籽油[13]的藥用、油用、香料、食用等方面，但未見關于紫蘇防治MS及多靶點抑制作用的研究。研究擬通過IC50值評價抑制活性，并采用分子對接驗證結果及預測更多潛在靶點，旨在為紫蘇作為食品添加劑預防和治療代謝綜合征的作用提供依據。

1 儀器與試劑

1.1 主要儀器

架盤藥物天平：IYT-10型，上海光正醫療儀器有限公司；

數顯控溫電熱套：SXKW型，北京市永光明醫療儀器廠；

電熱恒溫水浴鍋：DZKW-D-2型，北京市永光明醫療儀器廠；

超聲波清洗器：KQ-250B型，昆山市超聲儀器有限公司；

旋轉蒸發器：XD-52AA型，上海賢德實驗儀器有限公司；

干燥箱：101-1 型，上海市實驗儀器總廠；

紫外可見分光光度計：UV-1100 型，上海美譜達儀器有限公司；

高效液相色譜儀：Agilent 1260 LC型，美國安捷倫科技有限公司；

電子分析天平：SQP型，賽多利斯科學儀器北京有限公司；

砂芯過濾器：1 000 mL，上海申迪玻璃儀器有限公司；

酶標儀：ReadMax 1900/1900Plus型，上海閃譜生物科技有限公司。

1.2 試劑與試藥

紫蘇：2017—2019年采集于陜西西安、眉縣和甘肅正寧，經西安醫學院生藥教研室汪興軍老師鑒定為唇形科植物紫蘇PerillafrutescensL.Britt.；

無水乙醇：分析純，利安隆博華天津醫藥化學有限公司；

沒食子酸對照品：純度≥99%，天津市光復精細化工廠；

蘆丁、木犀草苷：HPLC≥98%，上海源葉生物科技有限公司；

甲醇：色譜純，廣東光華科技有限公司；

黃嘌呤氧化酶：美國Sigma公司；

黃嘌呤：純度≥95%，美國Sigma公司；

α-淀粉酶、3,5-二硝基水楊酸試劑(DNS)：西安姚北生物科技有限責任公司；

胰脂肪酶：上海阿拉丁生化科技有限責任公司；

對硝基苯丁酸酯(PNPP)：上海源葉生物科技有限公司；

N,N-二甲基甲酰胺、磷酸鹽緩沖液(PBS)、乙酰膽堿酯酶、5, 5-二硫代-2-硝基苯甲酸(DTNB)、多奈哌齊：美國Sigma公司。

無論是從胎兒到成人，從生食到高湯，還是從促進消化到潛在地降低鹽、糖攝入所引發的慢性病……鮮味一直陪伴在你我左右，無需恐鮮拒鮮。

1.3 分子對接軟件及數據庫

采用SYBYL-X2.1.1分子模擬軟件(USA)、ChemDraw繪圖軟件；采用TCMSP(https://old.tcmsp-e.com/)、RCSB(https://www.rcsb.org/pdb)和Pubchem(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)數據庫。

1.4 方法

1.4.1 粗提物的制備 稱取紫蘇葉100 g，用60%乙醇回流提取兩次，每次1 h，合并提取液，過濾，濾液減壓濃縮至無醇味，置于水浴鍋中濃縮得醇提物浸膏，50 ℃烘干得紫蘇粗提物。

1.4.2 總酚酸含量測定 采用福林酚法[14]。

1.4.3 總黃酮含量測定 采用亞硝酸鈉—硝酸鋁—氫氧化鈉比色法[15]。

1.4.4 木犀草苷含量測定 采用高效液相法，色譜條件：Agilent 5 HC C18250 mm×4.6 mm，柱溫為室溫，以甲醇—0.1%甲酸水(V甲醇∶V甲酸水為45∶55)為流動相，流速1.0 mL/min，波長360 nm。

1.4.5 體外α-淀粉酶活性抑制試驗 參照文獻[16-17]的方法并修改。精密稱取1 gα-淀粉酶，用PBS緩沖液配置成0.02 g/mL溶液，待用。精密稱1 g可溶性淀粉，先用少量沸水溶解，再定容至100 mL，煮沸至溶液澄清，取上清液備用。并按式(1)計算α-淀粉酶的抑制率。

(1)

式中：

RI——抑制率，%；

A1——空白組吸光度；

A2——空白對照組吸光度；

A3——抑制組吸光度；

A4——抑制對照組吸光度。

1.4.6 體外XOD活性抑制試驗 稱取30 mg黃嘌呤，加入2 mL氨水超聲溶解，用磷酸鉀緩沖液配制成0.1 mmol/L 的溶液，用時稀釋至0.01 U/L。取5 U黃嘌呤氧化酶，配制成0.5 U/mL，用時稀釋至0.1 U/mL，現配現用。以黃嘌呤為底物，通過酶標儀檢測3種藥材的XOD抑制活性。設置紫蘇粗提物質量濃度分別為0.05，0.10，0.20，0.30，0.40 mg/mL，設置空白組、空白對照組、抑制組和抑制對照組，每組總體積200 μL。將各樣品和50 μL黃嘌呤(0.01 U/L)共孵育5 min。加入50 μL XOD(0.1 U/L)引發反應(XOD需在25 ℃預孵30 min以穩定酶活)，混勻，測定295 nm處吸光度，按式(1)計算XOD抑制率，并以別嘌醇片為陽性對照[18]。

1.4.7 胰脂肪酶活性抑制測定 參照Liang等[19]的方法并修改。稱取0.05 g胰脂肪酶用緩沖液溶解定容至50 mL，8 000 r/min離心10 min，取上清液稀釋得胰脂肪酶溶液。稱取0.156 g PNPP，溶于0.25 mLN,N-二甲基甲酰胺，緩沖液定容得底物溶液。按式(1)計算PNPP抑制率。

1.4.8 乙酰膽堿酯酶活性抑制試驗 將乙酰膽堿酯酶配置成1.2 mmol/L溶液待用，用時稀釋10倍。稱取ATCH 3.5 mg定容至10 mL。稱取24 mg DTNB于10 mL 容量瓶。96孔板中每孔加入PBS 100 μL，乙酰膽堿酯酶(溶于pH 7.5 PBS中)20 μL，樣品溶液20 μL，0.12 mmol/L ATCh 20 μL作為酶反應底物。37 ℃培養30 min，加入20 μL質量分數為4%的SDS終止反應，加入0.6 mmol/L DTNB 20 μL，測定405 nm處吸光度，按式(2)計算乙酰膽堿酯酶抑制率，并以多奈哌齊為陽性藥。

R=[1-(A樣品-A背景)/A空白]×100%，

(2)

式中：

R——乙酰膽堿酯酶抑制率，%；

A樣品——加入樣品的反應體系的吸光度；

A背景——以PBS(pH 7.5)代替酶液的反應體系的吸光度；

A空白——以樣品溶劑代替樣品的反應體系的吸光度。

1.4.9 分子對接預測作用機制與靶點

(1) 小分子結構：將化合物3D結構導入SYBYL-X2.1.1中生成表單，再分別放入摩爾區進行能量最小化和加電荷處理，將處理好的結構保存至database數據庫中，以備后續對接。

(2) 蛋白質結構：從RCSB蛋白質數據庫中下載胰脂肪酶和α-淀粉酶的靶點蛋白晶體結構，利用SYBYL-X2.0軟件中的Surflex-Dock模塊對其進行結構處理，用于設定對接口袋。

(3) Surflex-Dock對接及評分標準：Surflex-Dock用于分子對接，Cscore用于評價結合打分的一致性，配體模式用于對接小分子化合物到受體的結合部位，小分子配體與相關蛋白的親和力打分用于評價其結合力，親和力打分越高，結合力越強、結合活性越高。用Total-Score打分函數對小分子與靶標相互作用進行評分，Total-Score函數綜合考慮了極性作用、疏水作用、焓和溶劑化等因素，該值愈大，對接復合物越穩定，小分子化合物與大分子蛋白質的匹配結合作用越好。Total-Score等于8為閾值，8分以上為匹配結合作用良好。

1.4.10 試驗數據處理 使用Origin 8.5軟件進行數據處理和作圖，采用SPSS Statistics 23.0軟件計算IC50值。

2 結果與分析

2.1 樣品提取率

紫蘇葉醇提取后最終得到干燥品18.59 g，提取率為18.59%。

2.2 總酚酸含量

沒食子酸標準曲線方程為y=5.453 0x+0.375 9，R2=0.975 4，吸光度與濃度呈良好的線性關系。試驗測得紫蘇粗提取物中總酚酸含量為58.59 mg/g。

2.3 總黃酮含量

蘆丁標準曲線方程為y=4.821 8x-0.003 8，R2=0.995 5，吸光度與濃度線性關系良好，試驗測得紫蘇粗提物中黃酮含量為0.309 8 mg/mg。

2.4 木犀草苷含量

木犀草苷標品及樣品的色譜圖見圖1，木犀草苷保留時間為8.236，峰面積為106.9。采用外標法測得樣品中木犀草苷含量為0.819 4 mg/g。

圖1 標準品和樣品的色譜圖Figure 1 Chromatography of the standards and samples

試驗發現，木犀草苷標準品的進樣量與峰面積的積分值的線性方程為Y=19.772X-3.85，R2=0.999 2，當木犀草苷質量濃度為38～152 mg/mL時線性關系良好。精密度試驗的RSD為0.36%，表明儀器的精密度良好。重復性試驗的RSD為1.97%，表明該方法重復性較好。穩定性試驗的RSD為1.52%，表明供試品溶液在36 h內穩定性良好。

2.5 紫蘇粗提物對α-淀粉酶的抑制活性

由圖2可知，紫蘇粗提物對α-淀粉酶活性抑制作用的IC50值為0.273 mg/mL，表明紫蘇粗提物對α-淀粉酶活性有一定的抑制作用，即紫蘇中含有的活性成分能夠抑制血糖水平，后續可對其進行進一步研究。

圖2 紫蘇粗提物對淀粉酶的抑制曲線Figure 2 Amylase inhibition curves of crude extracts of Perilla

2.6 紫蘇粗提物對黃嘌呤氧化酶的抑制活性

由圖3可知，紫蘇粗提物和別嘌醇對黃嘌呤氧化酶活性抑制作用的IC50值分別為0.244，0.319 mg/mL。與陽性對照藥別嘌醇相比，紫蘇粗提物對黃嘌呤氧化酶有一定的抑制活性，說明紫蘇中的活性成分可以降低尿酸水平。

圖3 紫蘇粗提物質量濃度與XOD酶抑制率的量效關系Figure 3 The dose-effect relationship between sample concentration and XOD enzyme inhibition rate

2.7 紫蘇粗提物對胰脂肪酶的抑制活性

由圖4可知，紫蘇粗提物和奧利司他對胰脂肪酶活性抑制作用的IC50值分別為0.347，0.614 mg/mL。與陽性藥奧利司他相比，紫蘇粗提物有較好的抑制胰脂肪酶作用，表明紫蘇粗提物可以降脂、治療肥胖代謝綜合征。

圖4 紫蘇粗提物對胰脂肪酶的抑制曲線Figure 4 Pancreatic lipase inhibition curves of the crude extracts

2.8 紫蘇粗提物對乙酰膽堿酯酶的抑制活性

由圖5可知，紫蘇粗提物對乙酰膽堿酯酶活性抑制作用的IC50值為0.018 mg/mL，說明紫蘇粗提物對乙酰膽堿酯酶有抑制作用，但相對陽性藥多奈哌齊(0.008 mg/mL)較差，需對粗提物進行深入研究。

圖5 紫蘇粗提物對乙酰膽堿酯酶的抑制曲線Figure 5 Inhibition curve of Perilla on acetylcholinesterase

2.9 分子對接預測紫蘇與胰脂肪酶和淀粉酶抑制作用靶點

將32種化合物與胰脂肪酶蛋白數據庫中1lpa、1lpb、1n8s 3個靶標蛋白進行分子對接，共分子對接96次，將32種化合物與α-淀粉酶的一個靶標蛋白5u3a對接32次，對接最佳結果見表1～表3，其中，與1n8s對接無化合物打分>8。由表1～表3可知，芹菜素-5-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素-7-二葡萄糖苷酸、芹菜素-7-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-蕓香苷、迷迭香酸、蘆丁等為紫蘇粗提物的有效活性成分。

表1 與胰脂肪酶1lpa對接最佳結果Table 1 Best results for docking with pancreatic lipase 1lpa

表2 與胰脂肪酶1lpb對接最佳結果Table 2 Best results for docking with pancreatic lipase 1lpb

表3 與α-淀粉酶5u3a對接最佳結果Table 3 Best results for docking with-amylase 5u3a

3 結論

探究了紫蘇粗提物對α-淀粉酶、黃嘌呤氧化酶、胰脂肪酶、乙酰膽堿酯酶的體外抑制活性。結果表明，紫蘇粗提物對4種酶均有抑制作用，表明紫蘇粗提物可有效防治以肥胖、高血糖、高尿酸血癥等為主的代謝綜合征。但多靶點體外篩選模型僅為代謝綜合征的治療提供參考，后續將通過體內整體動物試驗深入探究紫蘇粗提物的降脂、降糖、降尿酸作用。