冠突散囊菌對植物酚類物質的生物轉化及生物活性的影響

陳如揚，樊子依，潘一玲，高瑤，賀成，黃鈺昕，王遠亮，肖愈

（湖南農業大學食品科學技術學院，湖南 長沙 410128）

冠突散囊菌（E.cristatum）是茯磚茶中的有益微生物，也是茯磚茶后發酵過程中的優勢微生物，其產生的菌落色澤金黃，俗稱“金花”菌。長年飲用茯磚茶對人體有降血糖、降血脂、抗氧化等功效。據報道，冠突散囊菌是茯磚茶制作過程中的核心功能微生物之一，為茯磚茶獨特風味的形成做出重要貢獻，是形成茯磚茶菌花香氣的關鍵因素，在其生理活性功能的形成方面發揮重要作用[1-3]。此外，有研究發現，冠突散囊菌能在不同中草藥及植物基質上生長繁殖及代謝轉化，分解、轉化、催化及結構修飾（如去甲氧基、切斷糖苷鍵等）發酵基質中的生物活性成分，提高某些活性成分的含量以及產生新的活性成分，從而增強其功能。已有研究表明，冠突散囊菌對植物酚類具有潛在的轉化能力，并能產生豐富的代謝衍生物。黃群等[4]研究表明冠突散囊菌發酵產生的多酚氧化酶和過氧化物酶將茶多酚的主要成分兒茶素氧化為鄰醌，鄰醌氧化生成茶黃素，茶黃素再氧化聚合成茶紅素和茶褐素等。據報道，茶褐素具有降血脂[5]、降血糖[6]、抑菌[7]、抗氧化[8]、抗腫瘤[9]等多種功能活性。此外，Gu等[10]研究表明沙棘葉經冠突散囊菌固態發酵后，其中的蘆丁轉化為槲皮素、山奈酚和異鼠李素，且其抗氧化能力得到顯著增強。因此，本文就近年來冠突散囊菌對植物酚類成分的轉化及生物活性的影響進行綜述，旨在為冠突散囊菌在保健食品行業的應用提供新的研究思路與方向。

1 冠突散囊菌對植物酚類成分的轉化作用

1.1 茶多酚

茶多酚，包括黃烷醇類、羥類-4-黃烷醇類、花色苷類、黃酮醇類和黃酮類等化合物[11]。已有研究表明，經冠突散囊菌發酵后，成品茶的色澤、香氣等感官品質都有所改善，苦澀感減少，色澤更加澄清明亮，菌香味濃郁，而這與發酵過程中茶葉酚類成分的轉化有關。楊金梅等[12]以冠突散囊菌為菌種，對鐵觀音茶葉進行固態發酵，研究冠突散囊菌發酵對茶中主要化學成分的影響，結果表明，鐵觀音茶葉經發酵后其茶多酚含量下降，同時根據超高效液相色譜檢測結果分析表明發酵茶中增加了多種新成分。黃浩等[13]用冠突散囊菌發酵大紅袍、紅茶、綠茶、黑茶，采用高效液相色譜、高分辨質譜和核磁共振技術分析發現，發酵后的茶葉中出現兩種新的黃酮醇化合物，分別是槲皮素和山奈酚。新物質的產生可能是在冠突散囊菌分泌的酶以及熱的作用下將原本以黃酮苷形式存在于茶葉中的黃酮類化合物水解形成了黃酮醇化合物，即黃酮苷（結合態）被水解為黃酮和糖，再經過復雜的反應，最終羥基取代碳原子上的氫，形成黃酮醇。表1是關于冠突散囊菌發酵不同茶葉基質后對其茶多酚含量的影響。

表1 不同茶多酚經冠突散囊菌發酵后含量變化Table 1 Changes of different tea polyphenol content after E.cristatum fermentation

由表1可知，茶葉中多酚類成分的含量經冠突散囊菌發酵后發生了顯著變化，這可能與冠突散囊菌分泌的阿魏酸脂酶、多酚氧化酶等胞外酶有很大的關系。阿魏酸酯酶可以水解植物細胞壁中由阿魏酸、p-香豆酸及二聚阿魏酸等酚酸與半纖維素和木質素形成的酯鍵，降解木質纖維素，同時釋放出阿魏酸等物質[19]。兒茶素在冠突散囊菌分泌的過氧化物酶和多酚氧化酶等作用下，首先會氧化成醌類化合物，醌類化合物再氧化聚合形成茶黃素和茶紅素，這些茶色素再與多糖、蛋白質以及咖啡堿等物質聚合產生茶褐素，同時過氧化物酶也能將醌類物質直接氧化聚合生成茶褐素[5，20]。此外，有研究報道，冠突散囊菌能將酯型兒茶素轉化為脫酯型兒茶素和沒食子酸，這兩種物質再經過氧化聚合、環裂變和甲基化等一系列反應降解成小分子酚酸[3，20-21]。Xie等[22]報道，冠突散囊菌能轉化表沒食子兒茶素沒食子酸酯為二氫楊梅素及黃烷-3-醇B環裂解類似物，如茯磚素A。這些研究均表明，冠突散囊菌發酵對茶多酚具有顯著影響，可為冠突散囊菌在茶葉領域的應用提供一定的理論依據。

1.2 藥用植物多酚

我國藥用植物資源十分豐富，已被《全國中草藥名鑒》收錄的藥用植物有11 470多種[23]，不同的藥用植物含有不同酚類物質。冠突散囊菌對藥用植物多酚的生物轉化可能是通過發酵過程中分泌的胞外酶實現的。胡謝馨等[24]利用從茯磚茶中分離鑒定出的冠突散囊菌發酵野葛、粉葛、葛渣，并利用高效液相色譜技術分析發現，發酵后葛根素響應值升高，吸收峰面積增加，且有新的物質峰產生；野葛、粉葛、葛渣經冠突散囊菌發酵后，葛根素含量分別提高了20.48%、7.00%、20.29%。葛根素含量的變化，可能是因為冠突散囊菌在發酵過程中，分泌的一系列酶類，通過去糖基化、去甲基化、去羥基化等作用，將與葛根素結構相類似的異黃酮物質轉化為葛根素，從而提高葛根素的含量[25]。Zhang等[26]利用反相高效液相色譜技術分析發現，經冠突散囊菌發酵后，葛根中的葛根素及大豆苷元、黃豆黃素、染料木素含量顯著提高，而大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷含量顯著降低。Gu等[10]在茯磚茶中篩選得到具有高糖苷酶活性的散囊菌，用于固態生物轉化沙棘葉的成分，發現發酵7 d后，其總酚、總黃酮、槲皮素、山奈酚和異鼠李素含量均顯著增加，蘆丁含量減少，可能是蘆丁在散囊菌的作用下轉化為槲皮素-3-葡萄糖苷、山奈酚-3-葡萄糖苷、異鼠李素-3-葡萄糖苷，這些物質在散囊菌分泌的β-葡萄糖苷酶的作用下進一步轉化成了苷元型黃酮。表2列舉了3種藥用植物的多酚類物質在冠突散囊菌作用下的含量變化。

表2 不同藥用植物多酚經冠突散囊菌發酵后含量變化Table 2 Changes of polyphenol content in different medicinal plants after E.cristatum fermentation

有研究表明，冠突散囊菌有利于增加發酵基質中極性高的物質的含量，而極性高的物質有助于提高基質的生物利用度[29]。因此，冠突散囊菌可以考慮應用于藥用植物副產物中物質成分的轉化中，以提高其生物活性功能及藥用價值。Kong等[30]利用從茯磚茶分離出來的冠突散囊菌發酵中藥殘渣，對發酵產物進行分析發現了9種有藥用價值的蒽醌類物質，分別為石黃酸（parietinic acid），山扁豆酸（endocrocin），羥基大黃素（citreorosein），小麥長蠕孢菌素（tritisporin），大黃素（emodin），鏈蠕孢素（catenarin），大黃素甲醚（physcion），毛罌紅（erythroglaucin），2，2'-雙-長蠕孢素（2，2'-bishelminthosporin）。

1.3 豆類、谷物酚類物質

豆類、谷物中酚類化合物含量豐富，這些酚類化合物是其生物活性功能得以發揮的物質基礎，然而，有研究表明，這些酚類化合物中有很大部分是以不溶性形式存在的，大多數不溶性酚類物質與細胞壁化學物質（包括果膠、纖維素、木質素、阿拉伯木聚糖和結構蛋白）通過共價鍵、酯鍵、醚苷鍵等相結合，以結合形式出現，難以提取出來，嚴重影響其發揮生物活性功能[31]。目前有大量研究表明，微生物發酵可以顯著影響谷物、豆類中酚類物質的組成、含量和分布。表3列舉了豆類及谷物中多酚含量經冠突散囊菌發酵后的含量變化。

表3 豆類、谷物多酚經冠突散囊菌發酵后含量變化Table 3 Changes of polyphenol content in beans and grains after E.cristatum fermentation

由表3可知，經冠突散囊菌發酵后，燕麥、蕎麥、麩皮及豆類的一些多酚類物質成分的含量顯著提高。劉善鑫等[32]研究發現，在發酵溫度30℃，基質pH值6.0，接種量0.5%，發酵時間7 d的最優發酵條件下，燕麥經冠突散囊菌發酵后，燕麥黃酮含量達到最大值（58.13 mg/g），是未發酵燕麥的3.8倍，燕麥黃酮含量的變化與苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）活性的變化呈顯著正相關。這可能是因為PAL降低了細胞壁對黃酮類物質溶出的阻滯作用，從而使燕麥黃酮含量增加[39]。Liu等[40]研究發現，PAL可能是黃酮類物質合成的關鍵酶。Xiao等[41]利用冠突散囊菌發酵黑豆，發現發酵后黑豆中總酚和苷元型異黃酮含量顯著增加，而糖苷型異黃酮含量明顯減少。Chen等[36]利用冠突散囊菌發酵大豆，發現在發酵過程中，大豆總酚和苷元型異黃酮顯著增加，而糖苷型異黃酮明顯減少。固態發酵15 d后，大豆總酚、大豆苷元、染料木素和總苷元型大豆異黃酮分別比未發酵大豆高了1.9、10.4、8.4、9.4倍，這與冠突散囊菌發酵過程中產生的α-淀粉酶，β-葡萄糖苷酶，纖維素酶和蛋白酶密切相關，其中β-葡萄糖苷酶通過水解葡萄糖苷鍵，去糖基化，有利于糖苷型異黃酮轉化為苷元型異黃酮，最終增加苷元型異黃酮的含量。此外，Xiao等[37]利用冠突散囊菌生物轉化蕎麥，探討其代謝物變化規律，研究結果表明，蕎麥中總酚類物質經固態轉化后顯著增加，并進一步通過基于超高效液相色譜-串聯質譜的代謝組學技術分析發現，在負離子模式下，21種酚類物質（如咖啡酸、綠原酸、木犀草素、異鼠李素等）顯著上調，而只有7種酚類物質顯著下調。同時，冠突散囊菌將蕎麥中的香豆素生物轉化為咖啡酸。Lu等[38]利用冠突散囊菌發酵麩皮，發現發酵后麩皮的總酚、花青素含量增多，這可能與發酵過程中冠突散囊菌產生的木聚糖酶有關；發酵后麩皮中的阿魏酸含量大約是未發酵麩皮的12.06倍，這可能是由冠突散囊菌發酵過程中釋放的阿魏酸脂酶所導致的?？梢?，冠突散囊菌用于谷物、豆類生物轉化，其產生的酶能有效釋放多酚類物質，促進其結構轉化，產生新的代謝產物，增強其生物活性功能，有利于功能性食品的研究與開發。

1.4 其他植物多酚

冠突散囊菌除了對茶多酚、藥用植物多酚、谷類多酚、豆類多酚存在生物轉化之外，對其他植物多酚也存在轉化作用。郝鵬飛[42]將冠突散囊菌株3.0448接種于辣椒葉，并利用高效液相色譜技術研究冠突散囊菌發酵對辣椒葉成分的影響，結果發現發酵后物質發生了巨大的變化，產生了新的代謝產物，且多集中在石油醚與乙酸乙酯部位；并利用液液萃取、減壓硅膠柱色譜等方法，分離鑒定乙酸乙酯部位的發酵產物，分別是芹菜素、4'，7，8-三羥基黃酮、5-甲氧基-4'，7-二羥基黃酮、（Z）-6-[2-（3-（羥甲基）戊-1-烯-3-基）-1H-吲哚-3-基）亞甲基]-3-甲氧基-3-甲基哌嗪-2，5-二酮、曲黃素和芹菜素-7-O-β-D-芹糖（1→2）-β-D-葡萄糖苷。此外，利用氣相色譜-質譜聯用技術，鑒定了石油醚部位的6種發酵產物，分別為二氫獼猴桃內酯、十四烷酸甲酯、1，3，5-三甲基-4-正-十八烷基環己烷、棕櫚酸甲酯、油酸甲酯、十八烷酸甲酯。發酵前存在醇類和酸類化合物[43]，而發酵后石油醚部位主要是酯類化合物。由此推測，冠突散囊菌發酵促進酯化反應，產生較多的酯類物質，從而減少了發酵制品的苦澀味。詹欣[44]將冠突散囊菌接種于銀杏葉中，利用高效液相色譜技術，發現發酵后有新的物質生成，并對新增的峰進行目標分離，推測是咖啡因。表4為銀杏多酚經冠突散囊菌發酵后含量變化規律。

表4 銀杏多酚經冠突散囊菌發酵后含量變化Table 4 Changes of polyphenol content in Ginkgo biloba leaves after E.cristatum fermentation

由表4可知，在冠突散囊菌作用下，銀杏總黃酮含量上升，而銀杏酸含量下降。銀杏酸含量的下降可能是因為冠突散囊菌在發酵過程中分泌多酚氧化酶，而銀杏酸與兒茶素等酚酸類物質有相似的官能團，進而可能在多酚氧化酶的作用下，銀杏酸被氧化，導致其含量下降[47]。

2 冠突散囊菌發酵對植物生物活性的影響

2.1 抗氧化性

已有研究表明，微生物發酵對植物基質抗氧化活性產生顯著影響。詹欣等[48]利用冠突散囊菌發酵銀杏葉，研究不同發酵時間銀杏葉乙酸乙酯提取物的抗氧化活性，結果表明，發酵11 d的銀杏葉抗氧化活性最強，DPPH自由基及ABTS+自由基清除率的半抑制濃度（IC50）分別為 105.60 mg/L 和 102.09 mg/L，而未發酵的銀杏葉DPPH自由基及ABTS+自由基清除率的IC50為328.81 mg/L和226.75 mg/L。發酵后抗氧化活性的提高，與冠突散囊菌發酵過程中的轉化產物密切相關。Zhou等[49]用乙酸乙酯、石油醚、乙醇提取冠突散囊菌發酵的白芷中的活性物質，發現發酵后白芷不同溶劑提取物的抗氧化能力（ABTS+、DPPH自由基清除能力、鐵離子還原抗氧化能力）均強于發酵前相對應的提取物，同時利用一種高效液相色譜-二極管陣列檢測器-三重四極桿飛行時間串聯質譜-2，2'-聯氮-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽的方法分析，發現發酵后的白芷中存在12種具有抗氧化活性的物質，其中海膽靈（echinulin）、異白當歸腦（isobyakangelicol）、生 物 堿 E-7 （alkaloid E-7）、cristatumin F、2-（3E，5E-庚二烯基）-3，6-二羥基-5-（3-甲基-2-丁烯基）苯甲醛（isodihydroauroglaucin）、灰綠曲霉黃色素（flavoglaucin）這6種活性物質是發酵過程中產生的，均有利于提高其抗氧化活性。Zhang等[28]研究發現，葛根經冠突散囊菌發酵后，總酚、總黃酮的含量顯著增加，抗氧化能力也得到了提高，相關性分析和主成分分析結果均表明這與總酚和總黃酮的含量密切相關。杜靜等[50]研究表明，葛根經冠突散囊菌發酵后，體外的抗氧化活性增加；發酵前，葛根對DPPH自由基清除率的IC50值為2.217 7 mg/mL，發酵后為0.835 9 mg/mL；且發酵后葛根中葛根素、大豆苷元的含量分別是發酵前的1.6、4.9倍，而大豆苷的含量降低了近50%。研究發現，葛根中分離出來的5種異黃酮類化合物，即葛根素、大豆苷、大豆苷元、鷹嘴豆芽素A、染料木素，可以充當自由基清除劑，并抑制亞油酸過氧化和脂質氧合酶活性[51]。李鵬程等[52]利用冠突散囊菌發酵枸杞，發現冠突散囊菌可增加枸杞活性成分多酚、黃酮等的含量，并增強其抗氧化活性，主成分分析結果表明抗氧化活性與多酚和黃酮含量呈正相關。Xiao等[37]發現，蕎麥經冠突散囊菌發酵后，其抗氧化活性顯著增強，相關性分析發現這與酚類物質的增加密切相關；同時發酵過程中形成的生物堿及萜類物質也有助于抗氧化活性的增強。

2.2 降血脂活性

研究表明，冠突散囊菌在發酵過程中能產生豐富的降血脂成分，如茶褐素、洛伐他汀。Xiao等[5]采用冠突散囊菌PW-1發酵制備黑茶，研究從其中分離得到的茶褐素的降血脂活性，發現茶褐素具有很好的降脂效果，可以使斑馬魚100%的脂質水平降低至51.57%。尹慧慧等[53]以冠突散囊菌為菌種對甜菜粉進行發酵，可產生降血脂成分洛伐他汀，其產量可高達95 mg/kg。此外，在Jiang等[18]的細胞模型試驗中，冠突散囊菌發酵基質的降血脂活性的提高得到了證實。其研究發現，冠突散囊菌發酵的普洱茶乙酸乙酯提取物在60、80、100 μg/mL濃度時，對油酸誘導的HepG2細胞脂質抑制率分別為24.06%，31.03%和67.99%，抑制效果比發酵前好。

2.3 降血糖活性

有研究表明，植物基質經過冠突散囊菌發酵后可以提高淀粉酶及葡萄糖苷酶抑制活性，從而減少人體消化過程中葡萄糖的生成，降低血糖水平。劉善鑫[54]利用冠突散囊菌發酵燕麥，發現發酵6 d后燕麥對α-淀粉酶抑制率最高為87.7%，與未發酵的燕麥相比增加了29%。黃俊[55]研究發現，經冠突散囊菌發酵6 d后，甜蕎對α-淀粉酶抑制率為64.3%，與未發酵前相比，提升了34%。此外，也有研究表明，經冠突散囊菌發酵后的植物基質降血糖活性的提高與發酵產物存在一定的關系。Xiao等[37]研究發現，蕎麥經冠突散囊菌發酵后其α-葡萄糖苷酶抑制活性顯著增強，相關性分析發現這與酚類物質的增加密切相關；同時，也與發酵過程中生物堿及萜類物質的增加有一定的相關性。Li等[35]利用超高效液相色譜-串聯質譜技術，發現在冠突散囊菌的作用下，從發酵后的豆渣中發現兩種蒽醌類物質[大黃素（emodin）和大黃素甲醚（physcion）]含量分別為1.02 mg/100 g DW和42.24 mg/100 g DW；動物實驗中喂食患有二型糖尿病的小鼠和高脂飲食誘導胰島素抵抗的小鼠餐后食用發酵前和發酵后的豆渣，結果發現發酵后的豆渣降血糖能力更加明顯，可能是因為發酵后的豆渣含有蒽醌類物質，導致其抑制α-葡萄糖苷酶的作用增強，能夠減少餐后葡萄糖的釋放，具有抗二型糖尿病的潛力。

2.4 其他生物活性

有研究表明，植物基質經冠突散囊菌發酵后能提高其抑菌活性、抗腫瘤活性等。郝鵬飛[42]研究了冠突散囊菌發酵前后辣椒葉不同萃取部位的抗菌能力，發現發酵后乙酸乙酯部位、正丁醇部位以及水部位均顯示出了一定的抑菌活性，而發酵前只有水部位顯示出了抑菌活性，可能是因為發酵前后物質發生了變化。彭曉赟等[56]發現冠突散囊菌的4種次級代謝產物，即灰綠曲霉黃色素、2-（2'，3-環氧基-1'，3'-庚二烯基）-6-羥基-5-（3-甲基-2-丁烯基）苯甲醛、2-（2'，3-環氧基-1'，3'5'-庚三烯基）-6-羥基-5-（3-甲基-2-丁烯基）苯甲醛和 2-（3E，5E-庚二烯基）-3，6-二羥基-5-（3-甲基-2-丁烯基）苯甲醛，它們對3種腫瘤細胞（SF-268、MCF-7和NCI-H460）有較好的細胞毒活性。冠突散囊菌可以使植物基質的抑菌、抗腫瘤等生物活性提高這一特點有利于保健食品的開發。蘇二正等[57]發明了一種冠突散囊菌液體發酵白果的方法及其制備的產品，該產品具有抗腫瘤、免疫調節等功能，主要是因為冠突散囊菌發酵后具有多種新增物質，而這些物質具有抑菌、抗腫瘤、免疫調節等功能。

3 總結與展望

微生物轉化是植物多酚結構改變及生物活性功能增強的重要途徑之一。冠突散囊菌目前主要應用于茯磚茶的制作及其他茶葉產品的加工上，然而，其在藥用植物和食物基質上產生豐富的代謝酶系，展現出了強大的代謝轉化能力，其代謝轉化產物由于具有更強的生物活性功能將受到更加廣泛的關注。通過微生物發酵中藥材及食物基質的方法有望得到原來不存在的活性成分或者提高含量低的酚類活性成分（如抗氧化活性、降血脂活性、降血糖活性物質等），經過篩選，開發獲得具有特異性藥效及功能活性的成分。冠突散囊菌在植物活性成分的代謝轉化方面的研究將會受到更加廣泛的關注，而基于代謝組學及轉錄組學等技術的推廣將應用于研究冠突散囊菌代謝轉化的機理。