以a7nAChR為靶點治療急性呼吸窘迫綜合征及相關機制

李孟秦，王飛，楊秋燕，黃丹，曹小平

(1.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院急診醫(yī)學科；2.南充市第五人民醫(yī)院骨科，四川 南充 637000)

急性呼吸窘迫綜合征(acute Respiratory disease syndrome，ARDS)是由于各種肺內外因素導致的肺毛細血管內皮細胞和肺泡上皮細胞損傷。典型病理改變?yōu)閺浡苑伍g質和肺泡水腫、肺實變，頑固性低氧血癥是典型臨床表現(xiàn)[1]。ARDS的發(fā)病機制復雜，炎癥介導的損傷對其發(fā)生發(fā)展有重要作用。因此，通過調節(jié)炎癥反應治療ARDS一直是臨床及基礎研究的方向之一，但目前尚無確切有效的藥物治療方法[2]。Th17 細胞是繼Th1、Th2 細胞之后適應性免疫應答的又一效應細胞，是典型的促炎因子[3]，可誘導IL-6 和TNF-α表達。越來越多的研究[4]發(fā)現(xiàn)，膽堿能抗炎途徑(CAIP)在肺損傷的調控中發(fā)揮重要作用。CAIP是基于迷走神經遞質ACh 與免疫細胞的煙堿乙酰膽堿受體(a7nAChR)結合，從而抑制促炎細胞因子的釋放[5]。正向調控a7nAChR 可強有力抑制炎癥，有應用于治療炎癥性疾病治療的前景，如炎癥性腸病、關節(jié)炎、哮喘[6]。膽堿酯酶抑制劑導致的膽堿能神經興奮能減少鏈脲霉致糖尿病小鼠脾臟炎癥因子合成及Th17 分化[7]。擬膽堿藥物α7nACHR 激動劑是否能抑制Th17 反應性，從而減輕ARDS目前尚未見報道。本研究通過臨床研究及動物實驗探討a7nAChR激動劑的肺保護作用及可能的機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 臨床資料 選取2019年9月至2021年9月川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院急診醫(yī)學科收治的44例ARDS患者為研究對象，依據(jù)吸煙史分為吸煙組(n=30)和非吸煙組(n=14)，兩組患者年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)；依據(jù)ARDS基礎病因分為肺內-ARDS組(n=31)與肺外-ARDS組(n=13)，兩組患者在吸煙組與非吸煙組的比例比較，差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。納入標準：依據(jù)2012柏林定義診斷為ARDS的男性患者，年齡20～70歲。排除標準：(1)合并免疫缺陷的患者；(2)肺結核活動期、肺癌、COPD等慢性肺部疾病導致急性呼吸衰竭的患者。

表1 患者臨床資料比較

1.1.2 實驗動物 清潔級6～8周齡C57BL/6J雄性小鼠，體重約20 g。購自川北醫(yī)學院動物實驗中心。

1.1.3 藥物、試劑及主要儀器 LPS(索萊寶)；SYBR RT-PCR 試劑盒(寶生物工程有限公司)；ELISA試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；β-actin 抗體(武漢三鷹生物技術有限公司，中國)；兔抗RORγt(Abcam 公司，英國)；GTS-21(MCE公司，美國)；MLA(MCE公司，美國)；choline(Fisher Scientific，美國)；α-bungarotoxin(sigma，美國)。YS100 光學顯微鏡(日本尼康株式會社)；JYSCZ2 SDS-PAGE 蛋白電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司)；ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD，美國)。

1.2 方法

1.2.1 患者血漿白介素16及17(IL-6、IL-17)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)濃度檢測 患者入院后24 h內抽取患者外周血，采用 ELISA法檢測，操作嚴格試劑盒說明書進行。

1.2.2 實驗動物分組、造模及標本收集 24只小鼠隨機分對照組、LPS組、LPS+a7nAChR激動劑組、LPS+a7nAChR抑制劑組，每組各6只。4%水合氯醛(約0.1 mL/10 g)小鼠麻醉后建立ARDS小鼠模型：建立人工氣道后，通過氣管導管對照組給予等體積 PBS溶液，其余3組小鼠給予緩慢推注 50 μL無菌 LPS 溶液(濃度 1 μg/μL，總量 5 mg/kg)。建立ARDS模型前1 h，LPS+a7nAChR激動劑組小鼠予以腹腔注射choline (10 mg/kg)、LPS+a7nAChR抑制劑組小鼠予以腹腔注射α-bungarotoxin (1 μg/kg)，其余兩組小鼠給予腹腔注射等體積PBS溶液。在建立ARDS模型后48h水合氯醛麻醉后頸椎脫位法處死小鼠，行支氣管肺泡灌洗，收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)。打開胸腔，剪取肺組織。

1.2.3 肺組織HE染色 分離左上肺組織，10%多聚甲醛固定過夜、包埋、切片、HE 染色。隨機選取5個視野觀察，并依據(jù)美國胸科協(xié)會提出的肺損傷評分標準進行評分。

1.2.4 肺濕/干比重檢測 取右肺組織，放置于事先稱重的EP管中稱量肺濕重，再將樣本置于 80 ℃ 烤箱 48 h 至恒重后稱其干重。然后計算肺濕/干比重。

1.2.5 小鼠炎癥因子水平檢測 將BALF離心，收集上清液，用ELISA法檢測BALF 中IL-17、IL-6、TNF-α水平。

1.2.6 RT-PCR檢測 提取左下肺組織RNA，反轉錄后根據(jù) RT-PCR 試劑盒說明書進行RT-PCR 實驗。采用2- ΔΔ Ct法來測定RORγt基因相對表達量,內參為β-actin，重復3次,取平均值。

1.2.7 Western blot檢測 提取左下肺組織總蛋白。根據(jù)Western blot 試劑盒說明書進行電泳、轉膜、封閉，采用抗 anti-RORγt(1∶500)。二抗孵育后成像，計算灰度值。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 吸煙對ARDS患者血漿中IL-17水平的影響

吸煙組ARDS患者血漿中IL-17水平低于非吸煙組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

2.2 吸煙對ARDS患者血漿中TNF-α水平的影響

吸煙組ARDS患者血漿中TNF-α水平低于非吸煙組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

2.3 吸煙對ARDS患者血漿中IL-6水平的影響

吸煙組ARDS患者血漿中IL-6水平低于非吸煙組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

2.4 a7nAChR激動劑減輕LPS導致的小鼠急性肺損傷

與對照組相比，所有肺損傷小鼠均出現(xiàn)典型的急性肺損傷表現(xiàn)，包括肺泡水腫、肺泡間隔增厚及炎細胞浸潤。對照組肺損傷評分低于其余3組(P<0.05)，LPS+a7nAChR激動劑組肺損傷評分低于LPS組(P<0.05)，LPS+a7nAChR阻斷劑組肺損傷評分高于LPS組(P<0.05)。對照組肺組織濕/干比低于其余3組(P<0.05)，LPS+a7nAChR激動劑組肺組織濕/干比低于LPS組(P<0.05)，LPS+a7nAChR阻斷劑組肺組織濕/干比高于LPS組(P<0.05)。見圖4、圖5及圖6。

2.5 a7nAChR激動劑減輕小鼠肺部炎癥反應

以小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)中炎癥因子IL-17、IL-6、TNF-α濃度評價肺部炎癥反應水平，結果顯示，對照組小鼠BALF中IL-17、IL-6、TNF-α濃度低于其余三組(P<0.05)，LPS+a7nAChR激動劑組小鼠BALF中IL-17、IL-6、TNF-α濃度低于LPS組(P<0.05)，LPS+a7nAChR阻斷劑組小鼠BALF中IL-17、IL-6、TNF-α濃度高于LPS組(P<0.05)。見圖7。

2.6 a7nAChR激動劑下調小鼠肺組織RORγt蛋白及mRNA水平

對照組小鼠肺組織RORγt蛋白及mRNA水平低于其余三組(P<0.05)，LPS+a7nAChR激動劑組小鼠肺組織蛋白及mRNA水平低于LPS組(P<0.05)，LPS+a7nAChR阻斷劑組小鼠肺組織RORγt蛋白及mRNA水平高于LPS組(P<0.05)。見圖8。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，在男性ARDS患者中，吸煙者與非吸煙者相比，外周血中IL-17、IL-6、TNF-α水平低于非吸煙者(P<0.05)。類似的研究還有炎性腸病患者結腸黏膜中吸煙者比非吸煙者細胞因子水平顯著降低[8]，Guslandi M發(fā)現(xiàn)尼古丁可有效治療部分炎性腸病患者[9]，表明ARDS患者外周血中IL-17、IL-6、TNF-α水平降低可能與煙堿受體興奮有關。

動物實驗研究[10]發(fā)現(xiàn)，a7nAChR激動劑可減輕LPS導致的小鼠肺損傷評分及肺組織濕/干比重(P<0.05)，而抑制a7nAChR使小鼠肺損傷評分及組織濕/干比重增加(P<0.05)，與Ravikumar A.Sitapara等報道一致，提示a7nAChR可能是干預ARDS的重要靶點。炎癥反應已被證實在ARDS的發(fā)展中有重要作用[11]，IL-17、IL-6、TNF-α均為重要的炎癥因子。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS誘導的肺損傷小鼠BALF中炎癥因子IL-17、IL-6、TNF-α水平升高(P<0.05)，a7nAChR激動劑使其降低(P<0.05)，而a7nAChR抑制劑使其升高(P<0.05)，與膿毒癥的相關研究[12]一致，說明a7nAChR激動劑可能通過下調炎癥反應發(fā)揮肺保護作用。

Th17細胞已被證實可促進中性粒細胞的募集，發(fā)揮強大的促炎作用[13]。IL-17是Th17細胞關鍵的效應分子之一，是典型的可誘導IL-6和TNF-α表達的促炎細胞因子[14]。抑制Th17可減輕肺部炎癥反應[15]，而RORγt是調控Th17細胞分化的重要轉錄因子[16-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，肺損傷小鼠肺組織RORγt蛋白及mRNA水平均升高(P<0.05)，a7nAChR激動劑可下調肺損傷小鼠肺組織RORγt蛋白及mRNA水(P<0.05)，而a7nAChR抑制劑進一步促進其表達(P<0.05)，提示興奮a7nAChR可能通過在轉錄及翻譯水平抑制RORγt表達，從而抑制Th17分化。

綜上所述，a7nAChR可能是治療ARDS的潛在靶點，興奮a7nAChR可能通過抑制RORγt表達，降低Th17細胞反應性，減輕炎癥反應，從而發(fā)揮肺保護作用。