化學發光免疫分析法篩查隱匿性乙型肝炎病毒的應用價值

余照斌 葛晶晶 張廣清

[摘要]目的研究化學發光免疫分析法（CIA）在隱匿性乙型肝炎病毒（HBV）篩查中的價值。方法選取2019年5—12月于清遠市婦幼保健院進行 HBV 篩查的患者60例，所有患者均采用 CIA 進行 HBV 五項檢測進行初篩，將初篩中乙型肝炎表面抗原（HBsAg）（-）、乙肝核心抗體（HBcAb）（+）樣本進行復篩，并采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（FQ-PCR）法檢測各樣本中 HBV DNA 病毒載量，統計 CIA 檢測情況以及 HBsAg（-）、HBcAb（+）樣本復篩及 HBV DNA 檢測情況。結果60例 HBV 樣本 CIA 結果檢出 HBsAg（+）15例，陽性率為25.00%， HBsAg（-）、HBcAb（+）樣本39例。以 HBV DNA 檢測結果作為金標準， ELISA 檢測靈敏度為46.67%，特異度為66.67%; CIA 檢測靈敏度為86.67%，特異度為91.67%;與 ELISA 比較， CIA 檢查靈敏度、特異度更高（χ2=5.400、4.547，P=0.020、0.033）。結論 CIA 檢測 HBsAg 具有較高的靈敏度，但當樣本存在 HBsAg（-）、HBcAb（+）的情況下，需進行復篩和 FQ-PCR HBV DNA 檢測，以免造成漏診的情況。

[關鍵詞]隱匿性乙型肝炎病毒;化學發光免疫分析法;酶聯免疫吸附試驗;病毒載量;靈敏度

[中圖分類號] R512.6+2? [文獻標識碼] A?? [文章編號]2095-0616（2022）07-0146-04

Application? value? of chemiluminescence? immunoassay? in screening occult hepatitis B virus

YU? Zhaobin??? GE? Jingjing??? ZHANG? Guangqing

Maternal and Child Health Hospital of Qingyuan City， Guangdong， Qingyuan 511500， China

[Abstract] Objective To study the value of chemiluminescence immunoassay （CIA） in screening occult hepatitis B virus （HBV）. Methods A total of 60 patients who underwent HBV screening at Maternal and Child Health Hospital of Qingyuan City from May to December 2019 were selected as study subjects. All patients were initially screened for the five HBV markers by CIA， and samples of hepatitis B surface antigen （HBsAg）（-） and hepatitis B core antibody （HBcAb）（+） undergoing the initial screening were re-screened. The real- time fluorescence quantitative polymerase chain reaction （FQ-PCR） was used to detect the viral load of HBV DNA in each sample， and the CIA results and the re-screening and HBV DNA detection results of HBsAg （-） and HBcAb （+） samples were counted. Results In the CIA results of 60 HBV samples， 15 cases of HBsAg （+） samples were detected， with a positive rate of 25.00%， and 39 cases of HBsAg （-） and HBcAb （+） samples were detected. Using HBV DNA detection results as the gold standard， the sensitivity was 46.67% and the specificity was 66.67% for the detection by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）， and the sensitivity was 86.67% and the specificity was 91.67% for the detection by CIA. Compared with ELISA， CIA has higher sensitivity and specificity（χ2=5.400，4.547;P=0.020，0.033）. Conclusion CIA has a high sensitivity for detecting HBsAg， but when HBsAg （-） and HBcAb （+） are present in the sample， re-screening and HBV DNA detection by FQ-PCR are needed to avoid missed diagnosis.

[Key words] Occult hepatitis B virus; Chemiluminescence immunoassay; Enzyme-linked immunosorbent assay; Viral load; Sensitivity

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus， HBV）可以經血液、母嬰以及生殖細胞等方式進行傳播，是引起乙型肝炎的重要病原體[1]。乙肝表面抗原（HBsAg）是檢測 HBV 感染最常用的指標，酶聯免疫吸附試驗（ELISA）是其主要的檢測方法，具有成本低、操作簡單等優勢，但該方法靈敏度偏低，干擾因素較多，因此臨床應用存在一定的局限性。臨床上，將 HBsAg（-）但 HBV DNA（+）的現象稱為隱匿性 HBV，由于此種現象的患者也存在傳播的可能性，可對機體造成嚴重的危害，因此僅以 HBsAg（+）作為篩查標準可能導致漏診[2]。化學發光免疫分析法（CIA）是目前檢測 HBV 感染的常用方法，其具有靈敏度高的優勢，且屬于全自動操作[3-4]。本研究通過分析 CIA 在隱匿性 HBV 篩查中的價值，現報道如下。

1資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年5—12月于清遠市婦幼保健院進行 HBV 篩查的患者60例，年齡18～69歲，平均（38.88±4.79）歲，男43例，女17例。本研究相關操作符合倫理，經醫院醫學倫理委員會批準，參與研究者均知情且簽署同意書。納入標準：①年齡不小于18歲;②既往無肝腫瘤放化療和手術史患者;③對體格檢查、血液采樣以及本研究其他相關操作知情同意。排除標準：①其他類型（丙型、丁型）肝炎病毒患者;②合并人類免疫缺陷病毒感染患者;③存在免疫功能缺陷障礙患者。HBV 感染診斷標準[5]：由乙型肝炎病毒持續感染引發，可以分為乙型肝炎病毒 e 抗原（HBeAg）（+）慢性乙型肝炎和HBeAg（-）慢性乙型肝炎;HBeAg（+）慢性乙型肝炎： HBV DNA 定量水平>2×107 IU/ml，血清HBsAg>1×104 IU/ml，丙氨酸氨基轉移酶（ALT）持續或反復異常或肝組織學檢查有明顯炎癥壞死和/或纖維化（≥ G2/S2）;HBeAg（-）慢性乙型肝炎：血清 HBsAg（+）、HBeAg持續（-），多同時伴有抗-HBe（+）， HBV DNA 定量水平≥2×103 IU/ml， ALT 持續或反復異常，或肝組織學有明顯炎癥壞死和/或纖維化（≥ G2/S2）。隱匿性 HBV 感染診斷標準：血清 HBsAg（-）、HBcAb（+），且血清和/或肝組織中 HBV DNA（+）。

1.2 方法

所有患者均采集靜脈血2管，每管各5 ml，并分裝在帶分離膠真空采血管中送檢，以3000 rpm 的速率離心8 min 獲取血清。1管采用化學發光免疫分析法（CIA）配套試劑盒由鄭州安圖生物工程股份有限公司提供，進行 HBV 五項檢測，分別為 HBsAg、乙型肝炎病毒表面抗體（HBsAb）、HBeAg、乙型肝炎病毒 e 抗體（HBeAb）、乙型肝炎病毒核心抗體（HBcAb）。初篩出39例 HBsAg（-）、HBcAb（+）樣本，判定標準：信號值比臨界信號值（S/Co）≥1為有反應性（+）， S/Co<1為無反應性（-）。針對上述 HBsAg（-）、HBcAb（+）樣本進行復篩，分別采用 ELISA（試劑盒購自上海榮盛生物技術有限公司）、CIA 進行檢測。換用另1管血清進行是實時熒光定量聚合酶鏈式反應（FQ-PCR）法 HBV DNA病毒載量檢測，操作按照試劑盒說明進行，試劑盒購自湖南圣湘生物科技有限公司。以 HBV DNA 病毒載量>20 IU/ml 記為（+）。

1.3 觀察指標

所有患者均采用 CIA 進行 HBV 五項檢測進行初篩，將初篩中 HBsAg（-）、HBcAb（+）樣本進行ELISA、CIA 復篩，并采用 FQ-PCR 法檢測各樣本中 HBV DNA 病毒載量，統計 CIA 檢測情況、HBsAg （-）、HBcAb（+）樣本 ELISA、CIA 復篩及 HBV DNA 檢測情況，并以 HBV DNA 檢測結果作為金標準，計算 ELISA、CIA 對隱匿性 HBV 感染的診斷價值。

1.4 統計學方法

采用 SPSS 22.0統計學軟件進行數據處理，計量資料用均數±標準差（ x ± s）表示，采用 t 檢驗，計數資料用[n （%）]表示，采用χ2檢驗， P <0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 60份HBV樣本CIA檢測結果

以 HBsAg（+）和（-）為界，將60份 HBV 樣本 CIA 結果分為10種模式，檢出 HBsAg（+）15例，陽性率為25.00%。見表1。

2.2? HBsAg（-）、HBcAb（+）樣本復篩及HBV DNA檢測結果

將 HBsAg（-）、HBcAb（+）樣本39例分別進行 CIA 和 ELISA 復篩，ELISA 篩查出HBcAb強（+）樣本7例，陽性率為17.95%; CIA 篩查出HBcAb強（+）樣本13例，陽性率為33.33%; HBV DNA 檢測結果顯示病毒載量>20 IU/ml 樣本15例， HBV? DNA 陽性率為38.46%，以 HBV DNA 檢測結果作為金標準， ELISA 檢測靈敏度為46.67%，特異度為66.67%; CIA 檢測靈敏度為86.67%，特異度為91.67%;與 ELISA 比較， CIA 檢查靈敏度、特異度明顯提升（χ2=5.400、4.547， P=0.020、0.033）。見表2。

HBV DNA 檢測結果陽性樣本分為5種模式，與模式2、3比較，模式4、5 HBV DNA 陽性率有所升高。見表3。

3討論

HBV 感染是一個全球性的健康問題，HBsAg （+）是目前大多數國家篩查該感染的唯一標準，但在20世紀70年代，相關研究發現， HBsAg（-）也有可能引發 HBV 感染，即引出了隱匿性 HBV 感染的概念[6]。ELISA 是 HBV 感染經典的檢測方法，但該方法需要重復多次的加樣和洗板操作，容易摻雜較多的人為操作因素，從而對結果造成一定的影響，導致漏診[7-8]。且 ELISA 檢測的靈敏度也較差，加之隱匿性 HBV 感染患者可能存在基因突變的現象[9-10]，因此尋找一種對結果影響小、靈敏度更高的方法以降低漏診或者隱匿性 HBV 的情況出現很有必要。

CIA 是一種全自動化操作的 HBV 感染檢測方法，其可以避免因人為操作而對結果產生的誤差，從而相較于 ELISA 具有更高的準確度。同時，CIA 是檢測抗原和抗體免疫結合反應的一種 HBV 檢測方法，其可以對微量的抗原和抗體進行免疫標記和定量檢測，從而可以極大地提高檢測的靈敏度[11-12]。本研究中，在對樣本進行了 CIA 檢測之后，同時對 HBsAg（-）、HBcAb（+）樣本做了進一步的篩查，以檢驗是否存在漏診隱匿性 HBV 的情況。HBcAb是 HBV 感染患者體內比較穩定的抗體，HBcAb（+）的出現說明患者可能處在乙肝的慢性感染期或者恢復期，此時 HBV 病毒復制水平也較低，導致 HBsAg 濃度也較低，可能未達到試劑可測水平，從而產生病毒隱匿性，出現漏診的情況。本研究結果顯示，CIA 檢測陽性率為25.00%，高于普通水平，分析原因可能與樣本選擇的差異以及樣本量較小存在關聯。而復篩及 HBV DNA 檢測結果顯示，HBsAb（+）HBeAg（+）HBcAb（+）模式 HBV? DNA 陽性率最高，且整體陽性率也偏高，說明 CIA 檢測存在漏診的現象。劉曉紅等[10]采用 HBV DNA 檢測復篩 CIA 檢測發現的 HBsAg（-）、HBcAb（+）樣本也顯示，在該類樣本中存在隱匿性 HBV 感染的可能，且發生風險隨HBcAb反應性 S/Co 值升高而升高，與本研究結果相似。有研究[13]顯示，隱匿性 HBV 的出現，一個重要的原因可能是存在基因的突變，而HBsAb（+）HBeAg（+）HBcAb（+）模式的最高陽性率也表明，HBeAg（+）按照常規應該是有 HBsAg，但這種模式中 HBsAg 卻為（-），說明其不存在或者水平極低，這也表明隱匿性 HBV 患者可能存在基因的突變，與李韋杰等[14-15]的研究結果相似。對復篩中 ELISA、CIA 檢測結果進行分析顯示，與 ELISA 比較，CIA 檢測靈敏度、特異度明顯提升，說明 CIA 檢測可以提升對隱匿性 HBV 感染的診斷價值。

綜上所述，CIA 對 HBV 感染的檢測靈敏度較高，但還是存在隱匿性 HBV 的可能性，對于檢測中 HBsAg（-）、HBcAb（+）的患者需做進一步的核酸檢測，以降低漏診情況的發生。本研究選取病例數較少，可能會對結果造成一定的影響，在后續研究中，需擴大病例數進行更加具有代表性的研究;同時，雖然進行了初篩和復篩，但仍然存在漏診的病例，在后續研究中，需進行聯合檢測方法的研究或者尋找新的生物標志物來進一步提高隱匿性 HBV 感染檢測診斷率。

[參考文獻]

[1] Fukano K，WatashiK.From the Establishment of HepatitisB Virus Cell Culture Systems to Drug Discovery[J].YakugakuZasshi，2019，139（1）：81-87.

[2] Mak LY，Wong DK，Pollicino T，et al.Occult hepatitisB infection and hepatocellular carcinoma： Epidemiology， virology， hepatocarcinogenesis and clinical significance[J]. J Hepatol，2020，73（4）：952-964.

[3]龐棟，姜瑩，張翙，等.電化學發光免疫分析法聯合核酸檢測在酶聯免疫吸附法雙試劑 HBsAg+/-獻血者歸隊篩查中的應用[J].廣西醫學，2018，40（19）：2346-2348.

[4] Luo L，Zhou X，Pan Y，et al.A simple and sensitiveflow injection chemiluminescence immunoassay for chloramphenicol based on gold nanoparticle-loaded enzyme[J].Luminescence，2020，35（6）：877-884.

[5]中華醫學會感染病學分會，中華醫學會肝病學分會.慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）[J].中華肝臟病雜志，2019，27（12）：938-961.

[6] Tang Y，Liu X，Lu X，et al.Occult Hepatitis BVirus Infection in Maintenance Hemodialysis Patients： Prevalence and Mutations in "a" Determinant[J].Int J Med Sci，2020，17（15）：2299-2305.

[7] Ye X， Li T， Li R， et al.Molecular characteristics ofHBV infection among blood donors tested HBsAg reactive in a single ELISA test in southern China[J].BMC Infect Dis，2021，21（1）：83.

[8] Adeleke AS，Fasola FA，FowotadeA.ComparativeAnalys is of Rapid T es t and Enzym e L inked Immunosorbent Assay for Screening of Blood Donors for Hepatitis B Surface Antigen Seropositivity[J].West Afr J Med，2021，38（1）：19-23.

[9]李奇，張凱，思蘭蘭，等.隱匿性 HBV 感染患者HBVS 基因突變特點及突變病毒株致瘤性研究[J].傳染病信息，2019，32（3）：208-214.

[10]劉曉紅，單穎，孫朝慶，等.HBsAg 陰性伴HBcAb陽性+患者血清 HBV-DNA 含量檢測對隱匿性乙型肝炎病毒感染的檢出價值[J].陜西醫學雜志，2021，50（3）：362-365.

[11]鄧中鳳，陳萍，鄒楊.隱匿性乙型肝炎病毒感染血液透析患者的分子特性及轉歸[J].腎臟病與透析腎移植雜志，2020，29（4）：328-332.

[12]崔曉蕾.血站 HBV 篩查 ELISA 陰性 NAT 陽性標本的確認結果分析[J].中國輸血雜志，2019，23（3）：251-254.

[13]何成山，馬晨蕓，陸志成.化學發光免疫分析法檢測HBcAb陽性、HBsAg 陰性血清中隱匿性乙型肝炎病毒感染的分析[J].標記免疫分析與臨床，2019，26（1）：130-133，172.

[14]李韋杰，徐東平，韓佳琪，等.乙型肝炎自然進程中血清 HBV RNA 的動態變化及其與肝組織 HBV cccDNA的關系[J].標記免疫分析與臨床，2019，26（9）：1445-1451.

[15]周怡，史恩溢，曹誼，等.HBsAg 陰性獻血者隱匿性 HBV感染的血清學特征及其與病毒載量的關系[J].臨床輸血與檢驗，2017，19（6）：570-573.

（收稿日期：2021-07-23）