CDH13、PCDH8基因啟動子甲基化與卵巢癌患者臨床病理特征和預后的關系

王玎，李志英，李會，盧嬌

1 三峽大學附屬仁和醫院婦科，湖北宜昌443001；2 三峽大學婦科腫瘤研究所

卵巢癌是女性生殖系統常見的惡性腫瘤，根據國際癌癥研究機構發布的數據，2020 年全球卵巢癌新發病例約31.4 萬例，死亡病例約20.8 萬例［1］。在婦科三大惡性腫瘤中，卵巢癌的預后最差，其原因為卵巢癌位置深在，發病隱匿，臨床確診時多處于晚期，并且卵巢癌惡性程度高、易轉移和復發。目前，卵巢癌的發病機制尚不完全清楚，至今仍缺乏有效的早期診斷方法。表觀遺傳學改變與正常的生理過程和疾病的發生、發展存在密切聯系。DNA 甲基化是一種被廣泛研究的表觀遺傳學修飾方式。有研究報道，抑癌基因異常甲基化在腫瘤進展過程中扮演重要角色［2-3］。鈣黏蛋白13（CDH13）和原鈣黏蛋白8（PCDH8）均為鈣離子依賴性細胞黏附分子，可參與細胞間識別和黏附過程，與腫瘤細胞增殖、分化、遷移等生物學行為密切相關［4-5］。近年研究發現，CDH13 基因啟動子甲基化與非小細胞肺癌和肝癌的發生、發展密切相關［6-7］，而PCDH8 基因啟動子甲基化與前列腺癌和腎細胞癌的發生、發展密切相關［8-9］。但CDH13、PCDH8基因啟動子甲基化與卵巢癌的關系尚不明確。本研究觀察了CDH13、PCDH8基因啟動子甲基化與卵巢癌患者臨床病理特征和預后的關系。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015 年1 月—2016 年6 月三峽大學附屬仁和醫院收治的卵巢癌患者203 例。所有患者經術后病理檢查明確診斷。納入標準：①符合卵巢癌診斷標準；②年齡≥18 歲；③初診；④接受根治性或姑息性手術且術前未接受任何抗腫瘤治療；⑤臨床病理資料和術后隨訪資料完整。排除標準：①合并其他部位腫瘤者；②合并全身感染性疾病者；③合并心、肝、腎等重要臟器嚴重疾病者；④合并自身免疫性疾病者?；颊吣挲g27～73（47.58 ±9.54）歲，其中≥55歲67例、＜55歲136例；腫瘤直徑：

≥4 cm 119例，＜4 cm 84例；組織分化程度：低分化55例，中高分化148 例；TNM 分期：Ⅰ、Ⅱ期86 例，Ⅲ、Ⅳ期117 例；有淋巴結轉移91 例，無淋巴結轉移112例。本研究經三峽大學附屬仁和醫院倫理委員會批準（審批編號：20210016），患者或其家屬知情同意并簽署書面知情同意書。

1.2 CDH13、PCDH8 蛋白表達檢測 采用Western blotting 法。將手術切除的卵巢癌組織及其配對的癌旁組織（距腫瘤組織邊緣＞5 cm，經病理檢查明確為正常卵巢組織），液氮中速凍。取凍存的卵巢癌組織與癌旁正常組織，剪碎后置于研缽中，液氮下充分研磨成粉末，加入RIPA裂解液提取組織總蛋白。經BCA 法蛋白定量合格后，加入等體積2×SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸變性。取變性蛋白20 μg，SDSPAGE 分離。電泳結束，將蛋白電泳產物轉印至硝酸纖維素膜上，室溫封閉1 h 后，加入兔抗鼠CDH13、PCDH8、β-actin 一抗，4 ℃孵育過夜。次日，洗膜后加入FIFC 標記的山羊抗小鼠IgG 二抗，37 ℃孵育4 h。最后ECL顯色，暗室中曝光、顯影和定影。Tanon GIS-1000 數碼凝膠圖像分析系統分析各蛋白電泳條帶灰度值。以β-actin 為內參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.3 CDH13、PCDH8基因啟動子甲基化狀態檢測 采用甲基化特異性PCR 法。取凍存的卵巢癌組織與癌旁正常組織，剪碎后置于研缽中，液氮下充分研磨成粉末。采用基因組DNA 提取試劑盒抽提基因組DNA，亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA 后，分別采用CDH13、PCDH8 基因啟動子甲基化引物與非甲基化引物進行擴增。引物序列由北京天根生化科技有限公司設計合成。CDH13 基因啟動子甲基化引物：上游引物5′-TCGCGGGGTTCCTTTTTCGC-3′、下游引物5′-GACGTTTTCATTCATACACGCG-3′，非甲基化引物：上游引物5′-TTGTGGGGTTGTTTTTTGT-3′、下 游 引 物5′-AACTTTTCATTCATACACACA-3′；PCDH8 基因啟動子甲基化引物：上游引物5′-CTTATAAAGGTAAAGGCGGC-3′、下游引物5′-AAATCAGGCTCATTACGAAC-3′，非甲基化引物：上游引物5′-GGTTAGAAAGGTAAAGGTGG-3′、下游引物5′-AAAATCACACTCTTTACAAA-3′。PCR 反 應 體系共20 μL：2×Taq PCR MasterMix 10 μL，DNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，RNase-free 6 μL；反應條件：94 ℃5 min，94 ℃45 s、60 ℃30 s、72 ℃30 s共40個循環，最后72 ℃5 min。取擴增產物5 μL，2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。Marker 選擇DS2000，以甲基化酶處理的基因組DNA 作為陽性對照，以水代替DNA作為空白對照。甲基化陽性：甲基化引物擴增出目的條帶，而非甲基化引物未擴增出目的條帶；甲基化陰性：甲基化引物未擴增出目的條帶，而非甲基化引物擴增出目的條帶。

1.4 隨訪 所有患者出院后定期隨訪5 年，以患者死亡為終點，隨訪截至2021年6月或患者死亡，記錄患者生存情況，計算5年累積生存率。

1.5 統計學方法 采用SPSS26.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以±s表示，結果比較采用獨立樣本t檢驗。計數資料比較采用χ2檢驗。生存分析采用Kaplan-Meier 法，生存率比較采用Log-Rank檢驗。危險因素分析采用多因素Cox 比例風險回歸模型。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 卵巢癌組織與癌旁正常組織CDH13、PCDH8蛋白表達比較 卵巢癌組織CDH13、PCDH8 蛋白相對表達量分別為0.56 ± 0.18、2.21 ± 0.54，癌旁正常組織分別為1.18±0.33、3.02±0.63。卵巢癌組織CDH13、PCDH8蛋白相對表達量均低于癌旁正常組織（t分別為-15.754、-11.666，P均＜0.01）。

2.2 卵巢癌組織與癌旁正常組織CDH13、PCDH8基因啟動子甲基化狀態比較 卵巢癌組織CDH13、PCDH8 基因啟動子甲基化陽性率分別為62.56%（127/203）、75.86%（154/203），癌旁正常組織分別為8.87%（18/203）、7.88%（16/203）。卵巢癌組織CDH13、PCDH8基因啟動子甲基化陽性率均高于癌旁正常組織（χ2分別為127.459、192.718，P均＜0.01）。

2.3 CDH13、PCDH8 基因啟動子甲基化狀態與卵巢癌患者臨床病理特征的關系 見表1。

表1 CDH13、PCDH8基因啟動子甲基化狀態與卵巢癌患者臨床病理特征的關系［例（%）］

2.4 CDH13、PCDH8 基因啟動子甲基化狀態與卵巢癌患者預后的關系 截至2021 年6 月，共隨訪5～60 個月、中位隨訪時間42 個月，隨訪期間死亡77 例。卵巢癌組織CDH13 基因啟動子甲基化陽性患者5年累積生存率為56.69%，卵巢癌組織CDH13基因啟動子甲基化陰性患者5 年累積生存率為71.05%，卵巢癌組織CDH13 基因啟動子甲基化陽性患者5年累積生存率低于卵巢癌組織CDH13基因啟動子甲基化陰性患者（χ2=11.087，P＜0.05）。卵巢癌組織PCDH8 基因啟動子甲基化陽性患者5 年累積生存率為58.44%，卵巢癌組織PCDH8 基因啟動子甲基化陰性患者5 年累積生存率為73.47%，卵巢癌組織PCDH8 基因啟動子甲基化陽性患者5 年累積生存率低于卵巢癌組織PCDH8 基因啟動子甲基化陰性患者（χ2=14.796，P＜0.05）。見圖1、2。

圖1 卵巢癌組織不同CDH13基因啟動子甲基化狀態患者的生存曲線

圖2 卵巢癌組織不同PCDH8基因啟動子甲基化狀態患者的生存曲線

2.5 卵巢癌患者預后不良的影響因素分析 卵巢癌患者死亡者與存活者臨床病理資料比較見 表2。

表2 卵巢癌患者死亡者與存活者臨床病理資料比較［例（%）］

以卵巢癌患者預后（死亡=1，存活=0）為因變量，以年齡（≥55 歲=1，＜55 歲=0）、TNM 分期（Ⅲ、Ⅳ期=1，Ⅰ、Ⅱ期=0）、淋巴結轉移（有=1，無=0）、CDH13 基因啟動子甲基化狀態（陽性=1，陰性=0）、PCDH8基因啟動子甲基化狀態（陽性=1，陰性=0）為自變量，納入多因素Cox 比例風險回歸模型。結果發現，TNM 分期Ⅲ、Ⅳ期及有淋巴結轉移、CDH13 基因啟動子甲基化陽性、PCDH8 基因啟動子甲基化陽性均為卵巢癌患者預后不良的獨立危險因素（P均＜0.05）。見表3。

表3 卵巢癌患者預后不良的多因素Cox比例風險回歸分析結果

3 討論

卵巢癌是女性生殖器官常見的惡性腫瘤，其發病率僅次于宮頸癌和子宮內膜癌，但其病死率卻高居婦科惡性腫瘤首位。卵巢癌早期5年生存率超過90%，但卵巢癌早期癥狀不明顯，約70%患者確診時已處于晚期，而卵巢癌晚期5 年生存率僅30%左右［10-11］。目前，卵巢癌的發病機制尚不完全清楚，至今仍缺乏有效的早期診斷方法。表觀遺傳學是研究除DNA 序列變化外的其他機制引起的細胞表型和基因表達的可遺傳改變，包括DNA 甲基化、組蛋白修飾、染色質結構重構、非編碼RNA 調控等。表觀遺傳變異具有可逆性。因此，表觀遺傳學藥物能夠為惡性腫瘤提供新的治療策略［2］。DNA 甲基化是一種被廣泛研究的表觀遺傳學修飾方式。轉錄活躍基因啟動子上游區域DNA 甲基化可導致選擇性基因沉默，當抑癌基因沉默時可導致腫瘤發生，并能促進腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移等［12］。

CDH13 又稱T-鈣黏蛋白、H-鈣黏蛋白，是非典型鈣黏蛋白家族成員之一。CDH13 具有常見的鈣黏蛋白細胞外區的所有特征，但缺少跨膜結構和典型的細胞質區序列，能夠通過糖基磷脂酰肌醇錨定于質膜外表面，從而在細胞黏附、信號轉導、細胞生長調控等方面發揮重要作用［13］。CDH13 廣泛分布于正常細胞表面，但在多種惡性腫瘤細胞中表達下調甚至缺失，可作為抑癌基因參與惡性腫瘤的發生、發展［14-15］。XU 等［14］研究報道，胰腺癌組織CDH13表達顯著下調，異種移植過表達CDH13 能夠通過抑制Wnt/β-連環蛋白信號通路激活，抑制胰腺癌細胞增殖、侵襲和遷移。WANG 等［15］研究發現，乳腺癌和肺癌組織CDH13 基因啟動子甲基化陽性明顯升高，通過DNA 聚合酶β增強CDH13蛋白表達后，乳腺癌和肺癌細胞侵襲、遷移能力明顯受到抑制。本研究結果發現，卵巢癌組織CDH13 蛋白相對表達量低于癌旁正常組織，提示在卵巢癌組織中CDH13 蛋白表達受到抑制。進一步研究發現，卵巢癌組織CDH13基因啟動子甲基化陽性率明顯高于癌旁正常組織，并且CDH13 基因啟動子甲基化陽性與TNM 分期和淋巴結轉移有關，進一步說明卵巢癌組織CDH13 基因高度甲基化，CDH13 蛋白表達受到抑制，并且CDH13 蛋白低表達與卵巢癌惡性進展有關。本研究結果還發現，卵巢癌組織CDH13 基因啟動子甲基化陽性患者5年累積生存率低于卵巢癌組織CDH13基因啟動子甲基化陰性患者，說明CDH13 基因啟動子甲基化可能與卵巢癌患者預后有關；進一步通過多因素Cox 比例風險回歸分析發現，CDH13 基因啟動子甲基化陽性是卵巢癌患者預后不良的獨立危險因素，提示CDH13 基因啟動子甲基化有可能成為預測卵巢癌患者預后的生物標志物。

原鈣黏蛋白是鈣黏蛋白超家族中最大的一個亞群，PCDH8 為原鈣黏蛋白家族成員之一。以往研究多關注PCDH8 與神經系統疾病的關系。近年研究發現，PCDH8 異常表達還與腫瘤的發生、發展密切相關［16-17］。孫良璋等［16］研究報道，肺癌組織PCDH8蛋白表達下調，而上調PCDH8蛋白表達能夠通過抑制蛋白激酶B/糖原合成酶激酶-3β/β-連環蛋白信號通路激活，抑制肺癌細胞增殖、侵襲和遷移。YE等［17］研究發現，鼻咽癌組織PCDH8 蛋白表達下調，上調PCDH8 蛋白表達能夠通過抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白信號通路激活，從而發揮抑癌作用。雖然上述研究并未分析腫瘤組織PCDH8基因啟動子甲基化情況，但均發現腫瘤組織PCDH8 蛋白表達下調。近年謝小紅等［18］研究報道，PCDH8 基因啟動子甲基化與甲狀腺乳頭狀癌的發生風險增加有關。本研究結果發現，卵巢癌組織PCDH8 蛋白相對表達量低于癌旁正常組織，說明卵巢癌組織PCDH8蛋白表達下調。進一步研究發現，卵巢癌組織PCDH8 基因啟動子甲基化陽性率明顯高于癌旁正常組織，并且PCDH8基因啟動子甲基化陽性與TNM 分期和淋巴結轉移有關，提示卵巢癌組織PCDH8基因高度甲基化，PCDH8蛋白表達受到抑制，從而促進卵巢癌惡性進展。本研究結果還發現，卵巢癌組織PCDH8 基因啟動子甲基化陽性患者5年累積生存率低于卵巢癌組織PCDH8 基因啟動子甲基化陰性患者，說明PCDH8基因啟動子甲基化可能與卵巢癌患者預后有關；進一步通過多因素Cox比例風險回歸分析發現，PCDH8 基因啟動子甲基化陽性為卵巢癌患者預后不良的獨立危險因素，提示PCDH8 基因啟動子甲基化有可能成為預測卵巢癌患者預后的生物標志物。

綜上所述，卵巢癌組織CDH13、PCDH8 基因啟動子甲基化陽性明顯升高，并且與腫瘤TNM 分期、淋巴結轉移和患者預后密切相關。但本研究僅觀察了卵巢癌組織CDH13、PCDH8基因啟動子甲基化狀態，二者在卵巢癌發生、發展中的具體作用機制尚不清楚，還需進一步研究。