非小細胞肺癌患者血清外泌體miR-181a-5p和lncRNA CCAT1表達變化及其臨床意義

馬玲，張園，楊麗菲，單莉

1 新疆醫科大學附屬腫瘤醫院肺內一科，烏魯木齊830011；2 新疆醫科大學附屬腫瘤醫院檢驗科

肺癌是世界范圍內發病率和病死率最高的惡性腫瘤［1］。非小細胞肺癌（NSCLC）是肺癌最常見的類型，占肺癌總數的80%以上。NSCLC 早期臨床癥狀不典型，多數患者就診時已進展至中晚期，而中晚期患者即使積極采取手術聯合放療、化療等綜合治療，5 年總體生存率依然較低［2］。外泌體是具有脂質雙分子層膜結構的細胞外囊泡，直徑30～150 nm，天然存在于人體體液中，如血液、尿液、唾液等。外泌體可通過調節形態發生信號、免疫細胞招募和遺傳物質傳遞等方式，在細胞外微環境中發揮多種細胞生物學功能［3］。腫瘤細胞來源的外泌體能夠通過動態調節腫瘤微環境中免疫細胞、腫瘤相關成纖維細胞等，參與腫瘤血管生成、細胞外基質重塑等過程，從而促進腫瘤惡性進展［4］。非編碼RNA 是一類無蛋白編碼功能，但能調控基因表達的核酸分子，包括微小RNA（miRNA）、長鏈非編碼RNA（lncRNA）、轉運RNA 等。有研究發現，外泌體能夠調控腫瘤細胞的惡性生物學行為，有助于腫瘤的早期診斷和預后判斷［5］。在NSCLC 細胞系A549中miR-181a-5p能夠抑制原癌基因KRAS 表達，從而發揮腫瘤抑制作用［6］。lncRNA 結腸癌相關轉錄因子1（CCAT1）能夠通過促進腫瘤干細胞標志物SOX4 等表達，促進腫瘤細胞侵襲和遷移，并增加腫瘤細胞對順鉑的耐藥性［7］。但 目 前 血 清 外 泌 體miR-181a-5p、lncRNA CCAT1 表達與NSCLC 發生、發展的關系尚不完全清楚。為此，本研究觀察了NSCLC 患者血清外泌體miR-181a-5p、lncRNA CCAT1 表達變化，并分析其表達與患者臨床病理特征和預后的關系。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015 年1 月—12 月新疆醫科大學附屬腫瘤醫院收治的NSCLC 患者103 例（觀察組）。所有患者經組織病理檢查明確診斷。納入標準：①符合NSCLC 診斷標準；②初診，入院前未接受任何抗腫瘤治療；③臨床病理資料和隨訪資料完整。排除標準：①合并急性肺炎、肺膿腫等肺部感染性疾病者；②伴系統性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病者；③伴其他系統惡性腫瘤者；④中途因其他疾病死亡者。其中，男71例、女32例，年齡32～79（58.5±6.0）歲，有吸煙史40例；腫瘤直徑：≤5 cm 60例、＞5 cm 43例；病理類型：腺癌68例，鱗癌35例；組織分化程度：高中分化66 例，低分化37 例；臨床分期：Ⅰ、Ⅱ期71例，Ⅲ、Ⅳ期32 例；有淋巴結轉移30 例，無淋巴結轉移73 例。同期選擇在新疆醫科大學附屬腫瘤醫院體檢健康的志愿者27例（對照組），男18例、女9例，年齡31～67（56.8±6.2）歲。兩組性別、年齡具有可比性。本研究經新疆醫科大學附屬腫瘤醫院醫學倫理委員會批準（倫理批號：K-2020011），所有研究對象或其家屬知情同意并簽署書面知情同意書。

1.2 血清外泌體miR-181a-5p、lncRNA CCAT1表達檢測 觀察組入院次日，對照組體檢當日，采集清晨空腹肘靜脈血5 mL，3 000 r/min離心10 min、離心半徑10 cm，留取上層血清。按血清/血漿外泌體快速抽提試劑盒說明提取血清外泌體。采用TRIzol法抽提血清外泌體總RNA，經NanoDrop1000超微量分光光度計鑒定，OD260/OD280為1.9～2.1。按反轉錄試劑盒說明將總RNA 反轉錄為cDNA。以cDNA 為模板，按SYBR Green PCR Mastermix 試劑盒說明進行PCR擴增。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。引物序列：miR-181a-5p 上游引物5′-CGGAAGCTTCACTGCTCACTGGTTCTTGT-3'、下游引物5′-CCCGATATCGTAGTGTCGTCTGTAAGG-3'，lncRNA CCAT1 上 游 引 物 5'-GTCAGCCGCATCTTCTTTTG-3′、下游引物5'-GCGCCCAATACGACCAAATC-3'，U6 上游引物5'-TCGCTTCGGCAGCACA-3'、下游引物5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。PCR 反應體系共10 μL：cDNA 模板2 μL，上下游引物各0.5 μL，2 × SYBR Green PCR Mastermix 5 μL，雙蒸水2 μL；反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性15 s、62 ℃退火60 s、72 ℃延伸15 s 共40個循環。擴增反應結束，繪制熔解曲線，獲取循環閾值（CT）數。以U6 為內參，采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量。

1.3 隨訪 所有患者出院后采用電話或門診復查形式定期隨訪，每3個月隨訪1次，共隨訪5年，隨訪截至2020年12月，統計患者生存情況。

1.4 統計學方法 采用SPSS20.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以±s表示，結果比較采用獨立樣本t檢驗。相關性分析采用Pearson相關分析法。生存分析采用Kaplan-Meier法，生存率比較采用Log-Rank檢驗。預后影響因素分析采用多因素Cox比例風險回歸模型。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清外泌體miR-181a-5p、lncRNA CCAT1表達比較 觀察組血清外泌體miR-181a-5p、lncRNA CCAT1 相對表達量分別為0.631 ± 0.160、1.514±0.266，對照組分別為1.420±0.281、0.437±0.103。觀察組血清外泌體miR-181a-5p 相對表達量明顯低于對照組，血清外泌體lncRNA CCAT1 相對表達量明顯高于對照組（t分別為19.117、20.588，P均＜0.01）。

2.2 NSCLC 患者血清外泌體miR-181a-5p 表達與lncRNA CCAT1 表達的關系 Pearson 相關分析顯示，NSCLC 患者血清外泌體miR-181a-5p 相對表達量與lncRNA CCAT1 相對表達量呈負相關關系（r=-0.576，P＜0.01）。見圖1。

圖1 NSCLC患者血清外泌體miR-181a-5p表達與lncRNA CCAT1表達關系的散點圖

2.3 血清外泌體miR-181a-5p、lncRNA CCAT1表達與NSCLC患者臨床病理特征的關系 見表1。

表1 血清外泌體miR-181a-5p、lncRNA CCAT1表達與NSCLC患者臨床病理特征的關系

2.4 血清外泌體miR-181a-5p、lncRNA CCAT1表達與NSCLC 患者預后的關系 103 例NSCLC 患者治療后隨訪2～60個月，無失訪病例，隨訪期間死亡56例，5 年總體生存率為45.63%（47/103）。分別以miR-181a-5p、lncRNA CCAT1 相對表達量的均數為臨界值，將NSCLC 患者分為miR-181a-5p 低表達者50例（miR-181a-5p相對表達量＜0.631）與miR-181a-5p 高 表 達 者53 例（miR-181a-5p 相 對 表 達 量≥0.631）、lncRNA CCAT1 低 表 達 者54 例（lncRNA CCAT1 相對表達量＜1.514）與lncRNA CCAT1 高表達者49 例（lncRNA CCAT1 相對表達量≥1.514）。miR-181a-5p低表達者與高表達者5年總體生存率分別為34.0%（17/50）、56.6%（30/53），lncRNA CCAT1低表達者與高表達者5 年總體生存率分別為33.3%（18/54）、59.2%（29/49）。miR-181a-5p 低表達者5 年總體生存率明顯低于其高表達者（χ2=5.299，P＜0.05），而lncRNA CCAT1 低表達者5 年總體生存率明顯高于其高表達者（χ2=6.619，P＜0.05）。見圖2。

圖2 NSCLC患者不同血清外泌體miR-181a-5p、lncRNA CCAT1表達者的生存曲線

2.5 NSCLC 患者預后不良的影響因素分析 以NSCLC 患者預后為因變量（死亡=1，存活=0），以性別（男=1，女=0）、年齡（≥60 歲=1，＜60 歲=0）、腫瘤直徑（≥5 cm=1，＜5 cm=0）、病理類型（腺癌=1，鱗癌=0）、組織分化程度（低分化=1，高中分化=0）、臨床分期（Ⅲ、Ⅳ期=1，Ⅰ、Ⅱ期=0）、淋巴結轉移（伴淋巴結轉移=1，不伴淋巴結轉移=0）、血清外泌體miR-181a-5p 表達（低表達=1，高表達=0）、血清外泌體lncRNA CCAT1 表達（高表達=1，低表達=0）為自變量，納入多因素Cox 比例風險回歸模型。結果發現，臨床分期Ⅲ、Ⅳ期及伴淋巴結轉移、血清外泌體miR-181a-5p 低表達、血清外泌體lncRNA CCAT1 高表達是NSCLC患者預后不良的獨立危險因素（P均＜0.05）。見表2、3。

表2 NSCLC患者預后不良的單因素Cox比例風險回歸分析結果

3 討論

肺癌是對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤。據報道，2018 年全球肺癌新發病例達到220 萬例，死亡病例達到180 萬例［1］。NSCLC 是肺癌最常見的類型，占肺癌總數的80%以上。目前，臨床篩查NSCLC 主要依靠影像學檢查、腫瘤標志物以及支氣管鏡活檢等。但影像學檢查的特異度不高，易遺漏早期不典型NSCLC；支氣管鏡檢查是一種侵入性檢查手段，并不適合作為NSCLC 的篩查手段；NSCLC 篩查常用的腫瘤標志物，如細胞角蛋白19片段、癌胚抗原等，在臨床實踐中發現這些腫瘤標志物的靈敏度和（或）特異度不高［8］。因此，尋找新的血清腫瘤標志物對NSCLC 的早期診斷、靶向治療和預后判斷具有重要意義。

表3 NSCLC患者預后不良的多因素Cox比例風險回歸分析結果

血清外泌體檢測是近年新興的一種非侵入性液體活檢方法。外泌體是由細胞分泌的、由脂質分子膜包裹的囊泡狀結構，天然存在于人體體液中。外泌體能夠包裹非編碼RNA，使其免受核糖核酸酶催化活性的影響。肺癌細胞分泌的外泌體可攜帶miRNA、lncRNA 等非編碼RNA，這些非編碼RNA 能夠參與腫瘤起始并促進腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移等［9］。因此，檢測腫瘤患者血清外泌體中非編碼RNA 表達變化能夠準確反映腫瘤細胞的惡性生物學行為，在腫瘤早期診斷、監測腫瘤復發或進展以及判斷預后方面具有廣闊的應用前景。

miRNA 是一類內源性非編碼單鏈小分子RNA。成熟的miRNA 能夠參與形成沉默復合體，與下游靶基因mRNA結合后，降低靶基因mRNA的穩定性，在轉錄后水平調控靶基因的表達，從而參與多種疾病的發生、發展［10］。miR-181a-5p 是miRNA 家族成員之一，定位于人1號染色體。有研究報道，在前列腺癌、肺癌等腫瘤細胞中miR-181a-5p 表達顯著下調，其表達下調可引起下游癌基因Krüppel 樣因子17 異常表達，從而促進腫瘤細胞惡性增殖［9，11］。本研究結果發現，觀察組血清外泌體miR-181a-5p 相對表達量明顯低于對照組，并且其表達與腫瘤臨床分期、淋巴結轉移密切相關。提示miR-181a-5p 可能作為抑癌基因參與NSCLC 的發生、發展。有研究報道，腫瘤細胞miR-181a-5p 表達受上游lncRNA LUCAT1 調控，lncRNA LUCAT1 能夠結合并抑制miR-181a-5p表達，促進腫瘤細胞向G0/G1期轉換，從而使腫瘤細胞過度增殖［12］。LYU等［13］研究發現，miR-181a-5p表達下調可促進調控Wnt 抑制因子1 表達，導致Wnt/β-catenin 信號通路激活，誘導腫瘤細胞發生上皮間質轉化，從而促進腫瘤細胞的侵襲和遷移。本研究生存分析發現，血清外泌體miR-181a-5p 低表達與NSCLC 患者預后較差有關，并且血清外泌體miR-181a-5p 低表達是NSCLC 患者預后不良的獨立危險因素。因此，血清外泌體miR-181a-5p 表達檢測有助于判斷NSCLC 患者預后，有可能作為一種新的腫瘤標志物。

lncRNA 是一類長度超過200 個核苷酸的非編碼RNA，可分為基因間lncRNA、內含子lncRNA、重疊lncRNA 和反義lncRNA。lncRNA 能夠與DNA、RNA 或蛋白質相互作用，從而在表觀遺傳、轉錄和轉錄后水平調控基因的表達。研究證實，lncRNA 能夠參與多種疾病的發生、發展，如心血管疾病、腫瘤等［14-15］。CCAT1 是近年發現的具有腫瘤促進作用的lncRNA。有研究發現，在膀胱癌細胞中lncRNA CCAT1 表達上調，其表達上調能夠促進腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移等惡性生物學行為［16］。WANG 等［17］研究發現，lncRNA CCAT1 能夠通過激活下游絲裂原活化蛋白激酶/c-Myc 信號傳導途徑，促進血液系統惡性腫瘤進展。本研究結果發現，觀察組血清外泌體lncRNA CCAT1 相對表達量明顯高于對照組，并且其表達與腫瘤臨床分期、淋巴結轉移密切相關。提示lncRNA CCAT1 可作為癌基因參與NSCLC的發生、發展。YANG 等［18］研究發現，腫瘤細胞中癌基因c-Myc 能夠通過結合lncRNA CCAT1 基因啟動子E盒，上調lncRNA CCAT1 表達，從而促進腫瘤惡性進展。lncRNA CCAT1 能夠作為分子海綿在細胞核中結合并抑制miR-28-5p 表達，進而促進下游癌基因p68 和雄激素受體表達，促進雄激素受體調節基因表達，從而促進腫瘤惡性進展［19］。本研究生存分析發現，血清外泌體lncRNA CCAT1 高表達與NSCLC 患者預后較差有關，并且血清外泌體lncRNA CCAT1 高表達是NSCLC 患者預后不良的獨立危險因素。因此，血清外泌體lncRNA CCAT1 表達檢測有助于判斷NSCLC 患者預后，有可能作為一種新的腫瘤標志物。

本研究結果還發現，NSCLC 患者血清外泌體miR-181a-5p 表達與lncRNA CCAT1 表達呈顯著負相關關系，提示二者可能共同參與NSCLC 的發生、發展。有研究發現，腫瘤細胞lncRNA CCAT1 過表達可作為分子海綿結合miR-181a-5p，從而抑制miR-181a-5p的抑癌基因功能，進而促進腫瘤細胞過度增殖和遷移［20］。但目前二者在NSCLC 中的相互作用機制尚不清楚，有待于進一步研究。

綜上所述，NSCLC患者血清外泌體miR-181a-5p表達下調、lncRNA CCAT1 表達上調，二者表達呈負相關關系且與腫瘤臨床分期、淋巴結轉移和患者預后密切相關。