急性呼吸窘迫綜合征患兒血清miR-34b-5p水平變化及其與炎癥因子和預(yù)后的關(guān)系

徐春艷，謝菲，趙潔，陳瑞東，昝春香，田文秋，伊文霞，岳彬

1 滄州市中心醫(yī)院兒科，河北滄州061000；2 滄州市中心醫(yī)院兒保科

急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是兒科重癥監(jiān)護(hù)病房（PICU）常見的急危重癥［1-2］，起病急驟，病情進(jìn)展迅速，嚴(yán)重威脅患兒的生命安全［3］。目前，ARDS的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。但以中性粒細(xì)胞為主介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是形成肺毛細(xì)血管壁通透性增高性肺水腫的病理基礎(chǔ)，也是ARDS 發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［4］。微小RNA（miRNA）是一種非編碼小分子RNA，能夠通過影響靶基因的表達(dá)而調(diào)控Toll 樣受體、核因子κB、白細(xì)胞介素等介導(dǎo)的炎癥信號通路，在炎癥反應(yīng)中扮演重要角色［5］。miR-34b-5p 是miRNA家族成員之一。XIE等［6］研究發(fā)現(xiàn)，脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠肺組織miR-34b-5p異常表達(dá)，并且其異常表達(dá)與急性肺損傷程度密切相關(guān)。但miR-34b-5p是否參與ARDS 的發(fā)生、發(fā)展尚不明確。本研究探討了ARDS 患兒血清miR-34b-5p水平變化及其與炎癥因子和預(yù)后的關(guān)系。現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2019 年1 月—2021 年1 月滄州市中心醫(yī)院收治的ARDS 患兒106 例（觀察組）。所有患兒符合《兒童急性呼吸窘迫綜合征：兒童急性肺損傷會議共識推薦》［7］中ARDS 的診斷標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合ARDS診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡＜12歲；③臨床病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并自身免疫性疾病者；②合并血液系統(tǒng)疾病者；③合并惡性腫瘤者；④合并心源性肺水腫、肺結(jié)核等肺部疾病者；⑤合并先天性心臟病者。其中，男63例、女43例，年齡2～12（6.85±2.11）歲，體質(zhì)量12～49（25.45±6.60）kg。同期選擇在滄州市中心醫(yī)院體檢健康兒童63例（對照組），男40 例、女23 例，年齡2～12（6.72 ± 2.14）歲，體質(zhì)量14～51（26.08±6.72）kg。兩組性別、年齡、體質(zhì)量具有可比性。本研究經(jīng)滄州市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)［批準(zhǔn)編號：2020-031-01（Z）］，患兒家屬或監(jiān)護(hù)人知情同意并簽署書面知情同意書。

1.2 ARDS 病情判斷和預(yù)后評估 ARDS 患兒入院后參照《兒童急性呼吸窘迫綜合征：兒童急性肺損傷會議共識推薦》［7］，根據(jù)氧指數(shù)判斷ARDS 病情程度，其中輕度（氧指數(shù)≥4～8）40 例、中度（氧指數(shù)≥8～16）42例、重度（氧指數(shù)≥16）24例。根據(jù)《兒童急性呼吸窘迫綜合征：兒童急性肺損傷會議共識推薦》［7］規(guī)范治療28 d，死亡21例、存活85例。

1.3 血清miR-34b-5p 檢測 觀察組入院次日，對照組體檢當(dāng)日，采集清晨空腹外周靜脈血3 mL，3 000 r/min離心10 min、離心半徑8 cm，留取上層血清，-80 ℃冰箱保存。采用TRIzol 法抽提血清總RNA，經(jīng)紫外可見分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳鑒定，提取的總RNA 濃度、純度和完整性合格，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按TaKaRa 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件：42 ℃60 min，70 ℃10 min。以cDNA為模板，按PCR試劑盒說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列由北京深藍(lán)云生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。miR-34b-5p 上游引物5′-AATCCCTGACTCCAGAACG-3′、下游引物5′-TGGTAGACCAAGTCTGTGATGAT-3′，U6 上游引物5′-TATTGACATTAGTTAAT-3′、下游引物5′-TTTAGAAGACTCCCTAGAGTA-3′。PCR 反應(yīng)體系共20 μL：cDNA 模板4 μL，上下 游 引 物 各0.4 μL，SYBR Premix Ex Taq 8 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，DEPC水6.8 μL；反應(yīng)條件：95 ℃10 min，95 ℃15 s、60 ℃60 s、72 ℃35 s 共45 個循環(huán)。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，繪制熔解曲線，收集循環(huán)閾值（CT）數(shù)。以U6 內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算血清miR-34b-5p相對表達(dá)量。

1.4 血清IL-6、IL-17、TNF-α 檢測 觀察組入院次日，對照組體檢當(dāng)日，采集清晨空腹外周靜脈血3 mL，3 000 r/min離心10 min、離心半徑8 cm，留取上層血清，-80 ℃冰箱保存。采用ELISA 法檢測血清IL-6、IL-17、TNF-α。ELISA 試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。檢測儀器為Multiskan?FC 酶標(biāo)儀，所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.5 資料收集與分析 收集ARDS 患兒一般臨床資料、疾病相關(guān)資料、治療相關(guān)資料以及實(shí)驗(yàn)室檢查資料。其中，一般臨床資料包括性別、年齡、體質(zhì)量、病因、PICU 時間，疾病相關(guān)資料包括入院時急性生理學(xué)和慢性健康狀況評估Ⅱ（APACHE Ⅱ）評分［8］、首次機(jī)械通氣時氧指數(shù)，治療相關(guān)資料包括機(jī)械通氣時間、是否吸入一氧化氮、是否使用神經(jīng)肌肉阻滯劑、是否使用血管活性藥物，實(shí)驗(yàn)室檢查資料包括血清miR-34b-5p、IL-6、IL-17、TNF-α 水平。比較不同預(yù)后ARDS 患兒一般臨床資料、疾病相關(guān)資料、治療相關(guān)資料以及實(shí)驗(yàn)室檢查資料，將有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的資料納入多因素Logistic 回歸模型，分析ARDS 患兒預(yù)后不良的影響因素。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；偏態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較采用H檢驗(yàn)，進(jìn)一步兩兩比較采用Bonferroni校正檢驗(yàn)，兩組比較采用U檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman 秩相關(guān)分析法。影響因素分析采用多因素Logistic 回歸模型。預(yù)測效能分析采用受試者工作特征（ROC）曲線。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-34b-5p、IL-6、IL-17、TNF-α 水平比較 見表1。

表1 兩組血清miR-34b-5p、IL-6、IL-17、TNF-α水平比較

2.2 不同病情程度ARDS 患兒血清miR-34b-5p、IL-6、IL-17、TNF-α水平比較 見表2。

表2 不同病情程度ARDS患兒血清miR-34b-5p、IL-6、IL-17、TNF-α水平比較

2.3 ARDS 患兒血清miR-34b-5p 水平與血清IL-6、IL-17、TNF-α 水平的關(guān)系 Spearman 秩相關(guān)分析顯示，ARDS 患兒血清miR-34b-5p 水平與血清IL-6、IL-17、TNF-α 水平均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r分別為-0.666、-0.593、-0.608，P均＜0.01）。

2.4 ARDS 患兒預(yù)后不良的影響因素分析 不同預(yù)后ARDS 患兒一般臨床資料、疾病相關(guān)資料、治療相關(guān)資料和實(shí)驗(yàn)室檢查資料比較見表3。

表3 不同預(yù)后ARDS患兒一般臨床資料、疾病相關(guān)資料、治療相關(guān)資料和實(shí)驗(yàn)室檢查資料比較

以ARDS患兒預(yù)后（死亡=1，存活=0）為因變量，以機(jī)械通氣時間、APACHE Ⅱ評分、氧指數(shù)、IL-6、IL-17、TNF-α、miR-34b-5p為自變量，納入多因素Logistic回歸模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，機(jī)械通氣時間、APACHE Ⅱ評分、氧指數(shù)、IL-17為ARDS患兒預(yù)后不良的獨(dú)立危險因素，而miR-34b-5p則為其獨(dú)立保護(hù)因素（P均＜0.05）。見表4。

表4 ARDS患兒預(yù)后不良的多因素Logistic回歸分析結(jié)果

2.5 血清miR-34b-5p 水平對ARDS 患兒預(yù)后不良的預(yù)測效能分析 ROC 曲線分析顯示，血清miR-34b-5p 水平預(yù)測ARDS 患兒預(yù)后不良的曲線下面積為0.820（95%CI：0.733～0.888），其最佳截?cái)嘀禐?.620，此時其預(yù)測ARDS患兒預(yù)后不良的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度分別為71.43%、90.59%、86.79%。見圖1。

圖1 血清miR-34b-5p水平預(yù)測ARDS患兒預(yù)后不良的ROC曲線

3 討論

ARDS 是兒科常見的急危重癥之一，盡管近年來其治療理念和呼吸策略不斷更新，但患兒預(yù)后并未得到顯著改善，病死率仍高達(dá)24%［3］。因此，早期準(zhǔn)確判斷ARDS 患兒病情，及時實(shí)施個體化治療，對改善患兒預(yù)后具有重要意義。

ARDS 的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明，但目前普遍認(rèn)為炎癥反應(yīng)失控是其發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［9］。肺內(nèi)外各種致病因素引起的急性失控性炎癥反應(yīng)能夠引起肺水腫，并增加肺血管內(nèi)皮通透性，導(dǎo)致富含蛋白質(zhì)、炎癥細(xì)胞的水腫液進(jìn)入肺泡腔和肺間質(zhì)，最終引起ARDS［10］。IL-6、IL-17、TNF-α是體內(nèi)三種重要的促炎癥細(xì)胞因子，能夠參與多種疾病的免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)過程。有研究證實(shí)，IL-6、IL-17、TNF-α 在ARDS 的炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用［11-12］。本研究結(jié)果顯示，觀察組血清IL-6、IL-17、TNF-α 水平明顯高于對照組，并且隨著病情加重，ARDS 患兒血清IL-6、IL-17、TNF-α 水平逐漸升高。提示ARDS 患兒體內(nèi)存在明顯的炎癥反應(yīng)狀態(tài)，與以往研究［11-12］結(jié)果一致。

miRNA 是一類由19～25 個核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼RNA，在生物體內(nèi)廣泛存在。miRNA 主要通過與靶基因mRNA 的3′非翻譯區(qū)特異性互補(bǔ)結(jié)合，導(dǎo)致靶基因mRNA降解或翻譯抑制，進(jìn)而調(diào)控靶基因的表達(dá)［13］。近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 還能參與ARDS 的炎癥反應(yīng)過程［5］。miR-34b 為miRNA 家族成員之一，定位于人染色體11q23.1。miR-34b 在肺組織中特異性表達(dá)，既往作為抑癌基因主要用于肺癌的基礎(chǔ)或臨床研究［14-15］。miR-34b-5p 為miR-34b 5′端臂加工而來。XIE等［6］研究發(fā)現(xiàn)，脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠肺組織miR-34b-5p 表達(dá)明顯下調(diào)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-34b-5p 表達(dá)可減輕肺部炎癥反應(yīng)，延長急性肺損傷小鼠生存時間，對肺損傷具有保護(hù)作用。但miR-34b-5p對ARDS 是否具有類似作用尚不清楚。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組血清miR-34b-5p 水平明顯低于對照組，并且隨著病情加重，ARDS 患兒血清miR-34b-5p 水平逐漸降低。提示血清miR-34b-5p 水平與ARDS 發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，血清miR-34b-5p水平為ARDS患兒預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素，表明血清miR-34b-5p 水平升高對ARDS 患兒具有保護(hù)作用，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，ARDS 患兒血清miR-34b-5p水平與血清IL-6、IL-17、TNF-α 水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示miR-34b-5p 可能參與ARDS 病情進(jìn)展中的炎癥反應(yīng)過程。細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3 是天然免疫和獲得性免疫中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可負(fù)向調(diào)控JAK 激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子信號通路，從而參與調(diào)節(jié)肺部炎癥反應(yīng)［16］。而IL-6、TNF-α、IL-17 等炎癥細(xì)胞因子能夠通過誘導(dǎo)細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3 表達(dá)參與炎癥反應(yīng)過程［17］。ZHOU 等［18］研究證實(shí)，細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3 為miR-34b-5p 的下游靶點(diǎn)，上調(diào)miR-34b-5p 可抑制細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3表達(dá)，減輕急性肺損傷小鼠肺部炎癥反應(yīng)和肺泡上皮細(xì)胞凋亡。由此推測，miR-34b-5p 高表達(dá)可能通過抑制炎癥反應(yīng)在ARDS 患兒病情進(jìn)展中發(fā)揮保護(hù)作用。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，機(jī)械通氣時間、APACHE Ⅱ評分、氧指數(shù)均為ARDS 患兒預(yù)后不良的獨(dú)立危險因素。機(jī)械通氣時間越長，APACHE Ⅱ評分和氧指數(shù)越高，ARDS 病情越重，患兒預(yù)后越差。本研究ARDS 患兒預(yù)后不良者血清IL-6、TNF-α 水平顯著升高，但血清IL-6、TNF-α 水平并不是ARDS 患兒預(yù)后不良的獨(dú)立危險因素。ROC 曲線分析顯示，血清miR-34b-5p 水平預(yù)測ARDS 患兒預(yù)后不良的曲線下面積為0.820，其最佳截?cái)嘀禐?.620，此時其預(yù)測ARDS 患兒預(yù)后不良的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度分別為71.43%、90.59%、86.79%。提示血清miR-34b-5p 可作為ARDS 患兒預(yù)后評估的生物學(xué)指標(biāo)。

綜上所述，ARDS 患兒血清miR-34b-5p 水平明顯降低，隨著ARDS病情加重，血清miR-34b-5p水平逐漸降低；ARDS 患兒血清miR-34b-5p 水平與血清IL-6、IL-17、TNF-α 等炎癥因子水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；血清miR-34b-5p水平是ARDS 患兒預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素，并可作為ARDS 患兒預(yù)后評估的生物學(xué)指標(biāo)。但miR-34b-5p具體通過哪些途徑參與調(diào)控ARDS 炎癥反應(yīng)尚不清楚，有待于進(jìn)一步研究。