SLE 患者血清miR-202-3p、PS-PLA1 水平與疾病活動度和細胞免疫功能的關系

龐杰，李瑞娟，張宗芳，李艷霞，陶然，楊雯雯，許化恒

1 滄州市中心醫院風濕免疫科，河北滄州061000；2 中國建筑第二工程局職工醫院內三科

系統性紅斑狼瘡（SLE）是一種可累及多系統、多器官的自身免疫性疾病，以反復發作和體內產生多種自身抗體為特征。SLE 可發生于任何年齡，但以育齡期女性最為常見［1］。目前，SLE 的確切病因和發病機制尚不清楚。微小核糖核酸（miRNA）在真核生物中廣泛存在，可參與細胞的多種生物學過程，是基因表達關鍵的轉錄后調控因子。已有研究證實，多種miRNA 可參與SLE 的發病過程［2］。miR-202-3p 是一種與免疫反應調節密切相關的miRNA，具有調節先天性免疫和適應性免疫的作用。SHANG 等［3］研究發現，白癜風患者外周血miR-202-3p 水平顯著下調，說明miR-202-3p 可能與自身免疫性疾病的發生密切相關。磷脂酰絲氨酸特異性磷脂酶A1（PS-PLA1）是一種參與先天性免疫信號傳導的溶血磷脂介質，可通過調節TANK 結合激酶1 參與抗病毒的先天性免疫反應［4］。IWATA 等［5］研究認為，PS-PLA1 可作為預測自身免疫性疾病的血清生物標志物。由此推測，miR-202-3p、PS-PLA1 可能參與SLE 的發病過程，但目前尚缺少相關證據。本研究觀察了SLE 患者血清miR-202-3p、PS-PLA1 水平變化，并探討二者與疾病活動度和細胞免疫功能的關系。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017 年2 月—2021 年9 月滄州市中心醫院收治的初診SLE患者158例（觀察組）。所有研究對象符合2010年中華醫學會風濕病學分會《系統性紅斑狼瘡診斷及治療指南》［6］中的診斷標準。納入標準：①符合SLE診斷標準；②初診；③SLE疾病活動度指數（SLEDAI）評分≥5 分［7］；④年齡＞18 歲。排除標準：①入組前1個月內接受免疫抑制劑或激素治療者；②合并風濕性關節炎、系統性硬化癥、強直性脊柱炎、干燥綜合征等其他自身免疫性疾病者；③合并惡性腫瘤者；④合并感染性疾病或代謝性疾病者。其中，男15例、女143例，年齡21～55（36.5±4.4）歲；臨床表現：皮疹32例，肌肉、關節疼痛29例，口腔潰瘍35例，光過敏51例，頭疼12例；SLE疾病活動度［7］：輕度52 例、中度71 例、重度35 例，SLE 病程1～6（3.1±0.9）年，SLEDAI評分6～19（13.5±2.6）分，有SLE 家族遺傳史16 例。同期選擇在滄州市中心醫院體檢健康的志愿者76例（對照組），男8例、女68 例，年齡23～57（37.2±5.1）歲。兩組性別、年齡具有可比性。本研究經滄州市中心醫院醫學倫理委員會批準（倫理批號：20210121），所有研究對象或其家屬知情同意并簽署書面知情同意書。

1.2 血清miR-202-3p檢測 SLE 患者入組24 h內，對照組體檢當日，采集空腹肘靜脈血3 mL，置于干燥的試管中，室溫靜置30～60 min，688 × g 離心5 min，取上層血清。按miRNeasy Micro Kit 說明抽提血清總RNA，經NanoDrop?2000/2000c 超微量分光光度計鑒定，OD260/OD280為1.9～2.0。按miScriptⅡRT Kit 說明將總RNA 逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，按SYBR?Premix Ex Taq?Ⅱ試劑盒說明進行PCR 擴增。所有引物序列由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。引物序列：miR-202-3p 上 游 引 物5′-ACACTCCAGCTGGGAGAGGTATAGGGCA-3′，下游引物5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAG-3′；U6 上 游 引 物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下 游 引 物5′-AACGCTTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR 反 應 體 系 共25 μL：cDNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，Taq DNA聚合酶1 μL，dNTP 1.6 μL，10 × buffer 2 μL，RNase-Free ddH2O 補足至25 μL；反應條件：95 ℃15 min，94 ℃15 s、55 ℃30 s、70 ℃30 s共40個循環。PCR反應在Applied Biosystems?StepOne?實時定量PCR 儀上完成。反應結束，繪制熔解曲線，收集循環閾值（CT）數。以U6 為內參，采用2-ΔΔCT法計算血清miR-202-3p水平。

1.3 血清PS-PLA1 檢測 SLE 患者入組24 h 內，對照組體檢當日，采集空腹肘靜脈血3 mL，置于干燥的試管中，室溫靜置30～60 min，688×g離心5 min，取上層血清。采用Multiskan SkyHigh 全波長酶標儀、ELISA 法檢測血清PS-PLA1。ELISA 試劑盒購自四川邁克生物科技股份有限公司，所有操作嚴格按照試劑盒說明進行。

1.4 細胞免疫功能檢測 SLE 患者入組24 h內，對照組體檢當日，采集空腹肘靜脈血3 mL，置于含肝素的抗凝試管中，分別加入CD3-PE/CD4-FITC、CD3-PE/CD8-FITC、CD3-PE/CD56-FITC/CD16-APC 抗體30 μL，室溫避光孵育15 min。然后加入紅細胞裂解液2 mL，充分混勻，室溫避光孵育10 min，再加入磷酸鹽緩沖液500 μL重懸。FACS Calibur 流式細胞儀檢測CD3+、CD4+、CD8+T細胞，并計算CD4+/CD8+。

1.5 統計學方法 采用SPSS25.0 統計軟件。計量資料經Kolmogorov-Smirnov 檢驗符合正態分布，以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；兩組比較采用獨立樣本t檢驗。相關性分析采用Pearson 或Spearman 秩相關分析法。采用受試者工作特征（ROC）曲線分析血清miR-202-3p、PS-PLA1 水平對重度SLE 的鑒別診斷價值。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清miR-202-3p、PS-PLA1 水平比較 觀察組與對照組血清miR-202-3p 水平分別為5.02 ±1.19、12.05 ± 3.65，血 清PS-PLA1 水 平 分 別 為（76.09 ± 15.49）、（15.02 ± 3.68）μg/L。觀察組血清miR-202-3p 水平低于對照組，血清PS-PLA1 水平高于對照組（t分別為21.947、33.878，P均＜0.05）。不同疾病活動度SLE 患者血清miR-202-3p、PS-PLA1水平比較見表1。

表1 不同疾病活動度SLE患者血清miR-202-3p、PS-PLA1水平比較（±s）

表1 不同疾病活動度SLE患者血清miR-202-3p、PS-PLA1水平比較（±s）

注：與輕度比較，*P＜0.05；與中度比較，#P＜0.05。

SLE疾病活動度輕度中度重度FP n 52 71 35 miR-202-3p 12.91±2.69 10.72±3.42*7.90±2.36*#136.352＜0.01 PS-PLA1（μg/L）68.12±6.23 75.02±10.24*90.10±1.35*#96.352＜0.01

2.2 兩組細胞免疫功能比較 見表2。

表2 兩組細胞免疫功能比較（±s）

表2 兩組細胞免疫功能比較（±s）

組別觀察組對照組t P n 158 76 CD3+T細胞（%）73.26±10.42 89.18±16.37 9.013＜0.01 CD4+T細胞（%）40.32±5.16 48.47±8.02 9.371＜0.01 CD8+T細胞（%）35.06±9.68 30.15±8.11 3.822＜0.01 CD4+/CD8+1.15±0.29 1.89±0.35 17.063＜0.01

2.3 SLE 患 者 血 清miR-202-3p、PS-PLA1 水 平 與SLEDAI 評分和細胞免疫功能的關系 SLE 患者血清miR-202-3p 水平與SLEDAI 評分、CD8+T 細胞均呈 負 相 關 關 系（r分 別 為-0.506、-0.405，P均＜0.05），與CD3+、CD4+T 細胞及CD4+/CD8+均呈正相關關系（r分別為0.421、0.362、0.435，P均＜0.05）；SLE 患者血清PS-PLA1 水平與SLEDAI 評分、CD8+T細胞均呈正相關關系（r分別為0.469、0.377，P均＜0.05），與CD3+、CD4+T細胞及CD4+/CD8+均呈負相關關系（r分別為-0.353、-0.401、-0.389，P均＜0.05）。

2.4 血清miR-202-3p、PS-PLA1 水平對重度SLE 的鑒別診斷價值 ROC 曲線分析顯示，血清miR-202-3p 水平鑒別重度SLE 的曲線下面積（AUC）為0.697（95%CI：0.619～0.767），其最佳截斷值為13.02，此時其鑒別重度SLE的靈敏度為68.57%、特異度為69.92%；血清PS-PLA1 水平鑒別重度SLE 的AUC為0.717（95%CI：0.640～0.786），其最佳截斷值為81.35 μg/L，此時其鑒別重度SLE 的靈敏度為65.71%、特異度為72.36%；二者聯合鑒別重度SLE的AUC為0.903（95%CI：0.845～0.944），其鑒別重度SLE 的靈敏度為88.57%、特異度為89.43%。血清miR-202-3p、PS-PLA1 水平聯合時鑒別重度SLE的AUC高于二者單獨時（Z分別為4.417、3.311，P均＜0.01）。見圖1。

圖1 血清miR-202-3p、PS-PLA1水平鑒別重度SLE的ROC曲線

3 討論

SLE 是一種可累及多系統、多器官的自身免疫性疾病，其特征是體內產生多種自身抗體，這些自身抗體通過免疫復合物聚集等途徑造成多個系統或器官損害［8-9］。SLE的病因和發病機制尚不完全清楚，自身反應性T細胞活化促使免疫復合物聚集可能在其發病過程中扮演重要角色［10-11］。SLEDAI評分是評價SLE病情活動應用最廣泛的指標［12］。但SLEDAI評分在SLE早期診斷以及評估疾病活動度方面仍存在一定不足。因此，深入探索與SLE病情相關的生物標志物對其早期診斷、指導治療、預后評估具有重要意義。

miRNA 是參與基因表達關鍵的轉錄后調控因子，通過與靶信使RNA 特異性結合而抑制靶信使RNA 翻譯或降解靶信使RNA，從而調控基因的表達，繼而在細胞增殖、凋亡、新陳代謝以及免疫炎癥反應等生理和病理過程中發揮重要作用。有研究證實，miRNA 異常表達與各種自身免疫性疾病的發生密切相關［13］。miR-202-3p 屬于miR-202 家族成員之一，該家族的另一成員miR-202-5p已被鑒定為RIG-Ⅰ樣受體（RLRs）信號通路的負調節因子。RLRs 信號通路可在識別病毒感染和抗病毒先天性免疫反應中發揮重要作用，而miR-202-5p 可通過靶向三聯基序蛋白25 并負性調節其表達，抑制RLRs 信號通路激活，從而抑制免疫炎癥反應［14］。miR-202-5p 還可通過靶向MATN2 促進調節性T 細胞增殖和分化，從而參與過敏性鼻炎的發病過程［15］。有研究報道，miR-202-3p 對免疫反應亦具有調節作用，在金黃色葡萄球菌感染誘導的敗血癥中，miR-202-3p 可靶向結合PPARGC1A mRNA，并降低AML12 細胞PGC 轉錄共激活因子1α 表達，抑制Toll 樣受體信號傳導及其介導的先天性免疫反應［16］。在自身免疫性1型糖尿病中，miR-202-3p 可調節CC 趨化因子受體7 和CD247 mRNA 表達，促使T 淋巴細胞遷移和浸潤［17］。但目前miR-202-3p與SLE關系的報道較少。本研究結果發現，觀察組血清miR-202-3p 水平低于對照組，并且隨著疾病活動度增加，SLE 患者血清miR-202-3p 水平逐漸降低；進一步研究發現，SLE 患者血清miR-202-3p 水平與SLEDAI 評分呈正相關關系。提示miR-202-3p 與SLE 的發生、發展密切相關。本研究結果還發現，觀察組CD3+、CD4+T細胞及CD4+/CD8+均低于對照組，而CD8+T 細胞高于對照組，說明SLE 患者存在細胞免疫功能紊亂狀態；相關性分析發現，SLE 患者血清miR-202-3p 水平與CD3+、CD4+T 細胞及CD4+/CD8+呈正相關關系，與CD8+T細胞呈負相關關系。提示miR-202-3p能夠參與SLE自身免疫反應的調控過程，miR-202-3p 表達缺失可能通過激活免疫炎癥反應，導致SLE的發生、發展。

PS-PLA1 屬于胰脂肪酶家族成員，在肝臟、肺、前列腺等組織以及免疫細胞中廣泛表達。PS-PLA1能夠特異性水解磷脂酰絲氨酸或1-酰基-溶血磷脂酰絲氨酸的sn-1 脂肪酸，還可調節T 細胞、樹突細胞、巨噬細胞和肥大細胞等免疫細胞成熟及其功能，從而參與免疫炎癥反應過程，繼而在自身免疫性疾病的發病過程中發揮重要作用［5］。有研究報道，黑色素瘤患者血清PS-PLA1 水平顯著升高，并且其水平與病情程度和腫瘤細胞惡性生物學行為密切相關［18］。Graves 病、亞急性甲狀腺炎或無癥狀甲狀腺炎患者血清PS-PLA1 水平升高，并且血清PS-PLA1水平與甲狀腺激素水平呈正相關關系［19］。狼瘡性腎炎患者血清PS-PLA1 水平高于其他腎小球疾病患者，PS-PLA1 有望成為狼瘡性腎炎的血清生物標志物［5］。但目前PS-PLA1與SLE關系的報道較少。本研究結果發現，觀察組血清PS-PLA1水平高于對照組，并且隨著疾病活動度增加，SLE 患者血清PS-PLA1水平逐漸升高；進一步研究發現，SLE 患者血清PS-PLA1 水平與SLEDAI 評分呈正相關關系。提示PS-PLA1 可能參與SLE 的發生、發展。相關性分析發現，SLE患者血清PS-PLA1水平與CD3+、CD4+T細胞及CD4+/CD8+呈負相關關系，與CD8+T 細胞呈正相關關系。說明PS-PLA1能夠調節SLE 患者細胞免疫功能，血清PS-PLA1 水平升高可導致SLE 患者細胞免疫功能紊亂。

本研究ROC 曲線分析顯示，血清miR-202-3p、PS-PLA1 水平單獨時鑒別重度SLE 的AUC分別為0.697、0.717，二者聯合時鑒別重度SLE 的AUC為0.903，血清miR-202-3p、PS-PLA1 水平聯合時鑒別重度SLE 的AUC高于二者單獨時。結果表明血清miR-202-3p、PS-PLA1 水平對鑒別重度SLE 均具有一定臨床價值，二者聯合能夠提高其對重度SLE的鑒別診斷價值。

綜上所述，SLE 患者血清miR-202-3p水平降低、血清PS-PLA1 水平升高，并且二者與疾病活動度和細胞免疫功能紊亂密切相關。miR-202-3p、PS-PLA1可作為鑒別SLE病情程度的血清生物標志物。但本研究未能動態觀察血清miR-202-3p、PS-PLA1 水平變化以及二者與治療反應的關系，二者在SLE 發病中的具體機制仍需進一步研究。