電刺激對新生HIBD 大鼠腦組織IGF-1及其受體表達和神經軸索超微結構的影響

曹娟，王紅怡，石羽，文昌思，肖志云，簡麗琳

海南現代婦女兒童醫院兒科，海口571100

新生兒缺氧缺血性腦損傷（HIBD）是指在圍生期各種原因導致的腦部缺氧缺血性損害，是兒童發育落后、身體致殘的主要原因［1］。目前認為，新生兒HIBD的發病機制可能與興奮性氨基酸神經毒性、自由基氧化應激損傷、鈣離子超載、細胞凋亡等有關。針對HIBD 的發病機制，相應的治療措施隨之出現，如抑制氧自由基、抗神經細胞凋亡、促進神經生長等，盡管這些措施能夠取得一定療效，但均存在一定局限性［2］。電刺激是一種良好的物理治療手段，通過粘貼在體表的電極，將仿生物電無創引入小腦頂核。模擬實驗性小腦頂核電刺激而研制出的小腦電刺激儀已用于臨床，并取得了顯著療效［3-4］。但目前電刺激具體的作用途徑尚不明確［5］。胰島素樣生長因子1（IGF-1）是一種多肽類神經營養因子，在生理條件下，IGF-1 及其受體（IGF-1R）在中樞神經系統中廣泛表達。在病理條件下，IGF-1 和IGF-1R 表達上調，通過抑制細胞凋亡、調節離子通道活性、抑制一氧化氮毒性等途徑發揮神經保護作用［6］。神經軸索是有髓神經纖維的重要組成部分，也是構成神經元的軸突部分，在神經傳導中具有重要作用［7］。2020 年9 月—2021 年7 月，本研究觀察了電刺激對新生HIBD 大鼠腦組織IGF-1、IGF-1R 表達和神經軸索超微結構的影響。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級新生SD大鼠64只，雌雄不限，1周齡，體質量20～25 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，實驗動物生產許可證：SCXK（滬）2019-0006，動物質量合格證：2020-159。本研究經海南現代婦女兒童醫院動物倫理委員會批準（審批編號：2020003），實驗過程嚴格遵循“3R”原則。鹽酸氯胺酮，純度99.9%，購自美國Sigma公司。DF-90大鼠電刺激儀，購自上海玉研科學儀器有限公司；DMS-2型Morris水迷宮系統，購自中國醫學科學院藥物研究所；電子顯微鏡，購自日本奧林巴斯株式會社；NanoDrop分光光度計，購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；Chemi-Doc?XRS+化學發光成像系統，購自美國Bio-Rad公司。TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒，購自上海碧云天生物技術有限公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，購自德國Ferments Life Science 公司；SYBR?Select Master Mix，購自美國Life Technologies 公司；IGF-1一抗，購自美國Invitrogen公司；IGF-1R一抗，購自英國Abcam公司；GAPDH一抗，購自美國Cell Signaling Technology 公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗，購自英國Abcam公司；增強型化學發光試劑盒，購自德國Millipore公司。

1.2 動物分組、模型制備及干預方法 所有大鼠置于獨立通風籠具內，籠內溫度22～26 ℃，濕度（60±5）%，12 h/12 h明暗交替，自由攝食和飲水。所有大鼠適應性飼養1 周后，隨機分為對照組、模型組、氯胺酮組、電刺激組，每組16 只。模型組、氯胺酮組、電刺激組按標準Rice 法［8］構建HIBD 模型。對照組僅分離左頸總動脈，不結扎。模型組建模后立即予生理鹽水灌胃，氯胺酮組建模后立即予500 mg/kg氯胺酮灌胃，灌胃體積1.0 mL/100 g，每天1 次，連續4 周［8］。電刺激組建模后立即采用DF-90 大鼠電刺激儀低頻電刺激耳后部小腦頂核（相當于人體乳突部），電刺激強度和頻率以使大鼠肢體有震顫為宜，每次20 min，每天2 次（8：00、20：00），連續4周［9］。對照組不予干預，常規飼養。

1.3 神經功能缺損程度評估 干預4 周結束，參照Zea-Longa 的分級標準評估神經功能缺損程度。評分標準：0 分，無神經功能缺損；1 分，不能完全伸展癱瘓側；2 分，行走時向癱瘓側轉圈；3 分，行走時向癱瘓側傾倒；4 分，無法自發行走，存在意識喪失現象。神經功能缺損評分1～4分為HIBD 模型制備成功。神經功能缺損評分0分的新生大鼠排除實驗并重新補充。

1.4 學習記憶能力檢測 干預4 周結束，通過DMS-2 型Morris 水迷宮系統檢測逃避潛伏期、經過原平臺位置次數、原平臺象限停留時間。測試期間，保持環境安靜，水溫22～25 ℃。逃避潛伏期檢測時限80 s，找到原始平臺并停留5 s 以上判定為尋臺成功，將大鼠從入水到尋臺成功所需的時間記作逃避潛伏期。若80 s 內未能找到平臺則逃避潛伏期為80 s。分別從四個象限將大鼠放入水池中，取入水到尋臺成功所需時間的平均值作為逃避潛伏期。撤除平臺，將大鼠由原先平臺象限的對側放入水池中，記錄大鼠在目標象限（原先放置平臺的象限）所花的時間（原平臺象限停留時間）和進入該象限的次數（經過原平臺位置次數）。

1.5 腦組織病理觀察 水迷宮實驗結束，頸椎脫臼處死大鼠，止血鉗鈍性分離腦組織。取部分腦組織，4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規石蠟包埋，5 μm 厚連續切片。然后二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，Harris蘇木素染色液染色5～8 min，1%鹽酸乙醇分化，0.6%氨水反藍，伊紅染色液染色1～3 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察。

1.6 神經細胞凋亡檢測 取各組部分腦組織，4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規石蠟包埋，5 μm 厚連續切片。將切片脫蠟至水，蛋白酶K 工作液37 ℃反應15 min，TUNEL 反應混合液標記1 h，3%H2O2室溫孵育15 min，加入抗體稀釋液稀釋的生物素化抗地高辛抗體孵育30 min，然后加入抗體稀釋液稀釋的SABC 37 ℃反應30 min，最后DAB顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。隨機選取5個高倍鏡視野（400×），計數每視野TUNEL 陽性細胞數和細胞總數，計算神經細胞凋亡率。神經細胞凋亡率=TUNEL陽性細胞數/細胞總數×100%。

1.7 海馬神經元神經軸索超微結構觀察 取海馬組織，4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規石蠟包埋，制備超薄切片，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染，透射電鏡下觀察神經軸索超微結構。

1.8 IGF-1、IGF-1R 表 達 檢 測 ①IGF-1、IGF-1R mRNA表達檢測。取部分腦組織，采用TRIzol 法提取組織總RNA，經NanoDrop 分光光度計鑒定，提取的總RNA 純度和濃度合格。按RervertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 說明，將總RNA 逆轉錄為cDNA。以cDNA 為 模板，按SYBR?Select Master Mix 說明進行PCR 擴增。所有引物序列由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。引物序列：IGF-1上 游 引 物5′-TGCAGTGCCCAGTAGCTAGCTAGCTAGCT-3'、下 游 引 物5'-CGTAGCGATCGCTAGCGGTGTGACGAT-3'，IGF-1R 上游引物5'-CGTAGCGTGTCGCTAGCTAGCTAGCT-3'、下 游 引 物5′-CGTGTACGATCGATCGATCGATCGC-3'，GAPDH 上 游 引物5′-CGTGTAGCTGACGTGCGTGTGTGTG-3'、下游引 物 5'-CGTGAGCTAGCGTGTAGCTAGCTAG-3'。PCR 反應體系共20 μL：cDNA 模板2 μL，上下游引物各0.4 μL，2×SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ10 μL，去離子水7.2 μL；反應條件：95 ℃5 min，95 ℃45 s、40 ℃60 s、60 ℃20 s 共40 個循環。反應結束，收集循環閾值（CT）數。以GAPDH 為內參，采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量。②IGF-1、IGF-1R 蛋白表達檢測。取部分腦組織，液氮下勻漿，加入含磷酸酶抑制劑混合物的裂解液充分裂解，提取腦組織總蛋白，經BCA 法蛋白定量合格。然后加入上樣緩沖液，100 ℃水浴變性。取變性蛋白50 μg，SDS-PAGE分離。電泳結束，將蛋白電泳產物轉印至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入IGF-1、IGF-1R、GAPDH 一抗（稀釋比分別為1∶2 000、1∶2 000、1∶1 000），4 ℃孵育過夜。次日，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 二抗（稀釋比為1∶2 000），室溫孵育1 h，增強型化學發光試劑盒化學發光，暗室內曝光、顯影，采用ChemiDoc?XRS+化學發光成像系統檢測。以GAPDH 為內參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.9 統計學方法 采用SPSS24.0 統計軟件。服從正態分布且方差齊性的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組神經功能缺損評分和學習記憶能力比較 見表1。

表1 各組神經功能缺損評分和學習記憶能力比較（±s）

表1 各組神經功能缺損評分和學習記憶能力比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別對照組模型組氯胺酮組電刺激組n 16 16 16 16神經功能缺損評分（分）0.00±0.00 3.35±0.42*1.68±0.36*#1.65±0.43*#逃避潛伏期（s）14.69±2.39 27.98±3.28*18.88±2.29*#18.96±2.64*#經過原平臺位置次數（次）12.75±2.39 5.39±2.43*9.59±2.29*#9.69±2.19*#原平臺象限停留時間（s）28.59±3.21 12.74±3.24*22.95±2.84*#22.01±2.56*#

2.2 各組海馬組織病理觀察 對照組海馬組織結構正常；模型組海馬組織可見較多紅細胞，炎癥細胞浸潤明顯；氯胺酮組和電刺激組海馬組織紅細胞數量較模型組明顯減少，炎癥細胞浸潤亦明顯減輕。見圖1。

圖1 各組海馬組織病理觀察（HE染色，200×）

2.3 各組神經細胞凋亡率比較 對照組未發現神經細胞凋亡，模型組神經細胞凋亡率為（85.53 ±3.89）%，氯胺酮組為（34.75±4.69）%，電刺激組為（33.99±4.58）%。模型組、氯胺酮組、電刺激組神經細胞凋亡率均高于對照組（P均＜0.05），氯胺酮組、電刺激組神經細胞凋亡率低于模型組（P均＜0.05），而氯胺酮組與電刺激組神經細胞凋亡率比較P＞0.05。

2.4 各組海馬神經元神經軸索超微結構觀察 對照組神經軸索超微結構正常；模型組神經軸索突觸減少，間隙融合，線粒體數量減少；氯胺酮組和電刺激組神經軸索超微結構趨于正常。見圖2。

圖2 各組海馬神經元神經軸索超微結構觀察（醋酸鈾-枸櫞酸鉛染色，12 000×）

2.5 各組腦組織IGF-1、IGF-1R 表達比較 見表2。

表2 各組腦組織IGF-1、IGF-1R mRNA和蛋白表達比較（±s）

表2 各組腦組織IGF-1、IGF-1R mRNA和蛋白表達比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別對照組模型組氯胺酮組電刺激組n 16 16 16 16 IGF-1 mRNA 4.56±0.33 1.89±0.35*3.49±0.34*#3.47±0.36*#蛋白2.12±0.05 0.43±0.06*1.02±0.07*#1.04±0.04*#IGF-1R mRNA 4.23±0.23 0.93±0.24*2.38±0.29*#2.41±0.28*#蛋白2.33±0.03 0.39±0.04*1.34±0.05*#1.35±0.06*#

3 討論

HIBD 是圍產期窒息缺氧導致的腦缺氧缺血性損害，是導致新生兒癲癇、發育遲緩、運動障礙、認知障礙等神經功能障礙的主要原因。電刺激小腦頂核能夠啟動預防性或治療性中樞神經保護機制，如增加局部腦血流、抑制炎癥反應、保護神經組織結構、改善神經傳導等，對帕金森病、腦出血、腦萎縮等中樞神經系統疾病具有較好的預防和治療作用。目前，新生兒HIBD 的治療主要針對改善腦血流量和受損神經元的代謝功能、維持環境穩定和控制驚厥等。有研究發現，局部神經電刺激對顱腦損傷患者蘇醒和腦血液動力學具有顯著改善作用，不僅可增加腦血液灌注，縮小腦梗死面積，還可縮短腦損傷昏迷患者昏迷時間。KIMURA 等［10］研究發現，電刺激可增加新生HIBD 大鼠腦組織堿性成纖維生長因子表達，并且對大鼠內源性阿片肽具有正反饋作用，從而促進大腦功能恢復。有研究還發現，電刺激能夠顯著降低皮層細胞一氧化氮含量，減輕HIBD 大鼠皮層細胞損傷，而激活劑S-adenosyl-L-methionine 和胱硫醚-β-合成酶抑制劑羥胺則分別加重和減輕皮層細胞缺氧損傷［11-12］。本研究結果發現，與對照組比較，模型組、氯胺酮組和電刺激組神經功能缺損評分、逃避潛伏期、神經細胞凋亡率明顯升高，而經過原平臺位置次數、原平臺象限停留時間明顯降低；與模型組比較，氯胺酮組和電刺激組神經功能缺損評分、逃避潛伏期、神經細胞凋亡率明顯降低，而經過原平臺位置次數、原平臺象限停留時間明顯升高，而氯胺酮組與電刺激組上述指標比較差異無統計學意義。這表明電刺激對新生HIBD 大鼠腦神經具有明顯保護作用，與上述研究［10-12］結論基本一致。其機制可能是電刺激小腦頂核可改善微循環，使大腦半球血流量增加，從而改善腦組織缺血缺氧狀態。

神經軸索是有髓神經纖維的重要組成部分，也是構成神經元的軸突部分，在神經傳導中具有重要作用。有研究報道，在腦損傷狀態和基因突變情況下，神經軸索會出現不同程度損傷和變性，而外加一些干預因素則可促進神經軸索恢復。本研究結果顯示，對照組神經軸索超微結構正常；模型組神經軸索突觸減少，間隙融合，線粒體數量減少；而氯胺酮組和電刺激組神經軸索超微結構趨于正常。這提示電刺激對新生HIBD 大鼠神經軸索恢復具有促進作用。本研究還發現，對照組海馬組織結構正常；模型組海馬組織可見較多紅細胞，炎癥細胞浸潤明顯；氯胺酮組和電刺激組紅細胞數量減少，炎癥細胞浸潤亦明顯減輕。這提示電刺激對新生HIBD 大鼠腦缺血缺氧損傷具有抑制作用。有研究發現，小腦頂核電刺激可誘導針對腦缺血的神經保護作用，大鼠大腦中部動脈閉塞（MCAO）后立即給予小腦頂核電刺激1 h，可在24 h 后將梗死體積減少40%～50%［13］。此外，SHEFF 等［14］研究證實，在大鼠永久性MCAO 之前給予小腦頂核電刺激1 h 亦可減少梗死體積；當MCAO 延遲至小腦頂核電刺激后3 d 時，神經保護作用最為明顯，梗死體積減少約60%；在小腦頂核電刺激后7 d，梗死體積僅減少26%；當小腦頂核電刺激后3 周時，神經保護作用消失。提示小腦頂核電刺激可顯著增強腦組織對腦缺血的耐受性。

IGF-1 是一種多肽類神經營養因子，對哺乳動物的神經發育至關重要。IGF-1 的表達在神經細胞分化過程中達到頂峰，并且通過激活IGF-1R，促進神經細胞生存、分化、增殖、突觸外伸以及髓鞘形成等。IGF-1 也是一種有效的促有絲分裂因子，在大腦生長和發育過程中具有重要作用。在大腦中，IGF-1 信號傳導可促進神經元存活以及少突膠質細胞成熟和髓鞘形成。在經歷軸突生長、樹突成熟和突觸形成的區域中，IGF-1 表達瞬時升高，提示IGF-1 具有神經促進作用［15］。實驗性腦缺血后給予IGF-1 可減少神經元丟失和梗死體積，并促進腦內膠質細胞增殖和脊髓損傷后神經元存活［16］。IGF-1主要通過其受體IGF-1R 發揮作用，該受體在神經元、干細胞和大多數神經膠質細胞中表達。缺乏IGF-1R 的小鼠中樞神經系統發育可出現嚴重缺陷，這與IGF-1R在少突膠質細胞發育和髓鞘形成中的作用一致［17-18］。在中樞神經系統中，IGF-1R表達在早期發育階段較高，而在成年人中則明顯下降。腦缺血后6 h，大鼠海馬組織可觀察到IGF-1與IGF-1R 結合增加，這表明IGF-1R 含量增加［19］。本研究結果發現，與對照組比較，模型組、氯胺酮組和電刺激組腦組織IGF-1、IGF-1R mRNA與蛋白相對表達量均明顯降低；與模型組比較，氯胺酮組和電刺激組腦組織IGF-1、IGF-1R mRNA 與蛋白相對表達量明顯升高；而氯胺酮組和電刺激組腦組織IGF-1、IGF-1R mRNA與蛋白相對表達量比較差異均無統計學意義。這表明電刺激能夠促進新生HIBD 大鼠腦組織IGF-1、IGF-1R 表達，進而激活IGF-1/IGF-1R 信號通路。因此，電刺激對新生HIBD 大鼠腦組織的保護作用可能與促進IGF-1、IGF-1R表達有關。

綜上所述，電刺激對新生HIBD大鼠腦神經具有明顯保護作用，對神經軸索恢復具有促進作用，其機制可能與促進新生HIBD 大鼠腦組織IGF-1、IGF-1R表達，進而激活IGF-1/IGF-1R信號通路有關。