沉默lncRNA LINC00472 對脂多糖誘導腎小管上皮細胞損傷的影響及其機制

鄧琳，賀健祥，金蕾

1 上海中醫藥大學附屬曙光醫院創傷急救科，上海201203；2 江西中醫藥大學研究生院2021級博士班；3 上海滬東醫院皮膚科

急性腎損傷是臨床常見的危重癥，如果得不到及時有效治療，很容易轉化為慢性腎功能不全，最終發展為慢性腎衰竭。近年來，急性腎損傷的發病率逐年上升，但其發病機制至今仍未完全闡明。脂多糖（LPS）是革蘭陰性菌細胞壁的主要成分，可誘導人腎小管上皮細胞炎癥反應、氧化應激等，從而促進急性腎損傷發生。因此，LPS誘導的急性腎損傷模型成為目前研究急性腎病的重要工具［1-3］。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類轉錄本長度超過220 nt的內源性非編碼RNA 分子，可作為微小RNA（miRNA）的分子海綿調控炎癥反應、細胞凋亡等生物學過程，從而參與許多生理和病理過程。LINC00472作為lncRNA家族成員，在人支氣管上皮樣細胞16HBE 惡性轉化中表達上調，提示lncRNA LINC00472可能與肺損傷的發生密切相關［4］。miRNA 屬于內源性非編碼單鏈小RNA 分子，可通過特異性結合靶mRNA 的3′非編碼區而抑制其翻譯或表達，進而調控細胞增殖、分化、凋亡等生物學行為。miR-136-3p 作為miRNA 家族成員，在損傷心肌組織中表達下調，而其過表達則可通過Rho A/Rock信號通路減輕心肌損傷［5］。在線生物信息學網站預測顯示，lncRNA LINC00472 與miR-136-3p 存在結合位點。程序性細胞死亡因子4（PDCD4）是近年發現的一種腫瘤抑制因子。有研究發現，在腎缺血再灌注損傷小鼠腎組織中PDCD4表達顯著升高，而miR-21能夠通過調控PDCD4表達減輕腎缺血再灌注損傷［6］。在線生物信息學網站預測顯示，miR-136-3p 與PDCD4 存在結合位點。但目前lncRNA LINC00472/miR-136-3p/PDCD4 分子軸在急性腎損傷中的作用機制尚不清楚。2018年11月—2019 年7 月，本研究探討了沉默lncRNA LINC00472 對LPS 誘導的腎小管上皮細胞損傷的影響及其機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人腎小管上皮細胞系HK-2（以下稱HK-2細胞），購自上海弘順生物科技有限公司。si-NC 與si-LINC00472、miR-NC 與miR-136-3p、anti-miR-NC與anti-miR-136-3p引物序列均由廣州銳博生物科技有限公司設計合成。StepOne PlusTM實時熒光定量PCR 儀，購自美國ABI 公司；Victor3 1420 Multilable Counter 酶標儀，購自上海帝博思生物科技有限公司；FACS Calibur 流式細胞儀，購自美國BD 公司。TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒、SuperReal熒光定量預混試劑彩色版（SYBR Green），購自北京天根生化科技有限公司；IL-6、IL-8 ELISA試劑盒，購自武漢華美生物工程有限公司；熒光素酶檢測試劑盒，購自美國Promega公司。兔抗人PDCD4單克隆抗體、HRP標記的山羊抗兔IgG二抗，購自英國Abcam公司。

1.2 細胞培養 將HK-2 細胞接種于含10% FBS、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的DMEM 培養基，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養，隔天換液。待細胞生長融合80%左右時，按1∶3傳代。取傳3代、對數生長期、生長狀態良好的細胞進行后續實驗。

1.3 細胞分組與干預 取傳3 代、對數生長期、生長狀態良好的HK-2 細胞，以3×103個/孔接種于96孔板，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養。隨機將細胞分為對照組、LPS 組、LPS + si-LINC00472組、LPS+si-NC組、LPS+miR-136-3p組、LPS + miR-NC 組、LPS + si-LINC00472 + anti-miR-136-3p 組 和LPS + si-LINC00472 + anti-miR-NC 組，待細胞生長融合70%左右，按Lipofectamine2000 轉染試劑說明，LPS + si-LINC00472 組轉染si-LINC00472，LPS + si-NC 組轉染si-NC，LPS + miR-136-3p 組 轉 染miR-136-3p，LPS + miR-NC 組 轉 染miR-NC，LPS+si-LINC00472+anti-miR-136-3p組轉染 si-LINC00472、 anti-miR-136-3p， LPS + si-LINC00472 + anti-miR-NC 組 轉 染si-LINC00472、anti-miR-NC，轉染6 h 后更換新的培養基，同時給予1 μg/mL LPS 刺激24 h［7］。LPS 組不予轉染，同期給予1 μg/mL LPS 刺激24 h。對照組常規培養，不予轉染和LPS刺激。

1.4 lncRNA LINC00472、miR-136-3p 表達檢測 收集各組干預后細胞，采用TRIzol 法提取細胞總RNA，按照TIANScript cDNA 第一鏈合成試劑盒說明將總RNA 反轉錄為cDNA。以cDNA 為模板，按SuperReal熒光定量預混試劑彩色版（SYBR Green）進行PCR 擴增。引物序列：lncRNA LINC00472上游引物5'-GGAACGCTTCACGAATTTGCTGTCTCTCTCC-3'、下 游 引 物5′-GGGCCTCTCTGACCGTATCT-3'，GAPDH上游引物5′-GGGCCAAAAGGGTCATCATC-3'、下游引物5'-ATGACCTTGCCCACAGCCTT-3'；miR-136-3p 上游引物5'-ACACTCCAGCTGGGACTCCATTTGTTTT-3'、下游引物5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'，U6 上 游 引 物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'、下 游 引 物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。PCR 反應體系共20 μL：cDNA 模板2 μL，Real-Time PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，RNase-Free ddH2O 補足至20 μL；反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s 共40 個循環。擴增反應結束，繪制熔解曲線，收集循環閾值（CT）數。以U6 為內參，采用2-ΔΔCT法計算lncRNA LINC00472、miR-136-3p相對表達量。

1.5 細胞增殖活性檢測 收集各組干預后細胞，以1×103個/孔接種于96 孔板，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養。培養48 h，每孔加入5 mg/mL MTT溶液10 μL，繼續培養4 h，吸棄孔內培養基，加入DMSO 150 μL，于微量振蕩器中持續振蕩10 min，使結晶物充分溶解，Victor3 1420 Multilable Counter 酶標儀于450 nm 波長處檢測各孔的光密度（OD）值。以OD450值代表細胞增殖活性。

1.6 細胞凋亡檢測 收集各組干預后細胞，以1×104個/孔接種于6 孔板，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養。培養24 h，加入結合緩沖液500 μL 重懸細胞，然后加入Annexin V-FITC 5 μL，振蕩混勻，室溫避光孵育15 min；再加入PI 10 μL，振蕩混勻，室溫避光孵育10 min；1 h 內上FACS Calibur流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.7 培養上清液IL-6、IL-8 檢測 收集各組干預后的培養液，3 000 r/min離心5 min（離心半徑10 cm），留取培養上清液，采用ELISA 法檢測培養上清液IL-6、IL-8。所有操作嚴格按照IL-6、IL-8 ELISA 試劑盒說明進行。

1.8 PDCD4 蛋白表達檢測 收集各組干預后細胞，加入含PMSF 的RIPA 裂解液抽提細胞總蛋白，經BCA 法蛋白定量合格。加入上樣緩沖液，煮沸變性后SDS-PAGE 分離。電泳結束，將蛋白電泳產物轉印至PVDF 膜上，3% BSA 封閉過夜。次日，加入PDCD4 單克隆抗體（稀釋比1∶800）、GAPDH 單克隆抗體（稀釋比1∶1 000），室溫孵育45 min，加入HRP標記的山羊抗兔IgG 二抗（稀釋比1∶2 000），室溫孵育30 min。TBST 充分洗滌，ECL 發光，暗室中曝光、顯影、定影。采用Image J 軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以GAPDH 為內參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.9 靶向結合位點預測與驗證 通過LncBase Predicted v.2 在線預測網站預測lncRNA LINC00472 與miR-136-3p 的靶向結合位點，通過starBase 數據庫預測miR-136-3p 與PDCD4 的靶向結合位點。構建野生型（WT）-LINC00472、WT-PDCD4 重組熒光素酶質粒和突變型（MUT）-LINC00472、MUT-PDCD4重組熒光素酶質粒。取傳3代、對數生長期、生長狀態良好的HK-2 細胞，以1 × 103個/孔接種于96 孔板，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養。隨機分為WT-LINC00472 + miR-136-3p 組、MUTLINC00472 + miR-136-3p 組、WT-LINC00472 + miRNC 組、MUT-LINC00472 + miR-NC 組，WT-PDCD4 +miR-136-3p 組、MUT-PDCD4 + miR-136-3p 組、WTPDCD4+miR-NC 組、MUT-PDCD4+miR-NC 組。待細胞生長融合70%左右時，按Lipofectamine2000轉染試劑說明，WT-LINC00472 + miR-136-3p 組、MUTLINC00472 + miR-136-3p 組、WT-LINC00472 + miRNC 組、MUT-LINC00472 + miR-NC 組相應轉染WTLINC00472、MUT-LINC00472、miR-136-3p、miR-NC，WT-PDCD4 + miR-136-3p 組、MUT-PDCD4 + miR-136-3p組、WT-PDCD4+miR-NC組、MUT-PDCD4+miRNC 組相應轉染WT-PDCD4、MUT-PDCD4、miR-136-3p、miR-NC。轉染48 h后，吸棄孔內培養基，按熒光素酶檢測試劑盒說明檢測熒光素酶活性。

1.10 統計學方法 采用SPSS21.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；兩組比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LPS誘導對HK-2細胞lncRNA LINC00472、miR-136-3p表達及細胞增殖活性、細胞凋亡率和培養上清液IL-6、IL-8水平以及PDCD4蛋白表達的影響 見表1。

表1 LPS誘導對HK-2細胞lncRNA LINC00472、miR-136-3p表達及細胞增殖活性、細胞凋亡率和培養上清液IL-6、IL-8水平以及PDCD4蛋白表達的影響（±s）

表1 LPS誘導對HK-2細胞lncRNA LINC00472、miR-136-3p表達及細胞增殖活性、細胞凋亡率和培養上清液IL-6、IL-8水平以及PDCD4蛋白表達的影響（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05。

組別對照組LPS組lncRNA LINC00472相對表達量1.00±0.00 4.69±0.12*miR-136-3p相對表達量1.00±0.00 0.20±0.02*細胞增殖活性（OD450值）1.32±0.07 0.54±0.03*細胞凋亡率（%）7.82±0.56 23.52±1.05*IL-6（ng/mL）5.47±0.46 27.15±1.11*IL-8（ng/mL）1.70±0.13 19.64±1.00*PDCD4蛋白相對表達量0.14±0.01 0.70±0.06*

2.2 沉默lncRNA LINC00472 對LPS 誘導后HK-2細胞lncRNA LINC00472、miR-136-3p 表達及細胞增殖活性、細胞凋亡率和培養上清液IL-6、IL-8 水平以及PDCD4蛋白表達的影響 見表2。

表2 沉默lncRNA LINC00472對LPS誘導后HK-2細胞lncRNA LINC00472、miR-136-3p表達及細胞增殖活性、細胞凋亡率和培養上清液IL-6、IL-8水平以及PDCD4蛋白表達的影響（±s）

表2 沉默lncRNA LINC00472對LPS誘導后HK-2細胞lncRNA LINC00472、miR-136-3p表達及細胞增殖活性、細胞凋亡率和培養上清液IL-6、IL-8水平以及PDCD4蛋白表達的影響（±s）

注：與LPS+si-NC組比較，*P＜0.05。

組別LPS+si-NC組LPS+si-LINC00472組lncRNA LINC00472相對表達量4.68±0.10 1.40±0.08*miR-136-3p相對表達量0.21±0.02 0.79±0.05*細胞增殖活性（OD450值）0.53±0.03 1.13±0.06*細胞凋亡率（%）23.53±0.96 12.77±0.58*IL-6（ng/mL）27.27±1.13 9.81±0.63*IL-8（ng/mL）19.76±0.99 5.68±0.49*PDCD4蛋白相對表達量0.69±0.07 0.26±0.02*

2.3 過 表 達miR-136-3p 對LPS 誘 導 后HK-2 細胞miR-136-3p 表達、細胞增殖活性、細胞凋亡率及培養上清液IL-6、IL-8 水平和PDCD4 蛋白表達的影響 見表3。

2.4 沉默lncRNA LINC00472并抑制miR-136-3p表達對LPS誘導后HK-2細胞miR-136-3p表達、細胞增殖活性、細胞凋亡率及培養上清液IL-6、IL-8 水平和PDCD4蛋白表達的影響 見表4。

2.5 lncRNA LINC00472、miR-136-3p、PDCD4 的靶向調控關系 經LncBase Predicted v.2在線預測網站和starBase 數據庫預測，lncRNA LINC00472 與miR-136-3p存在靶向結合位點，miR-136-3p與PDCD4存在靶向結合位點，見圖1。WT-LINC00472+miR-136-3p組熒光素酶活性為0.29 ± 0.02，MUT-LINC00472 +miR-136-3p組為1.03±0.11，WT-LINC00472+miRNC 組為1.01 ± 0.10，MUT-LINC00472 + miR-NC 組為0.96±0.08，WT-LINC00472+miR-136-3p組熒光素酶活性明顯低于MUT-LINC00472+miR-136-3p組、WT-LINC00472 + miR-NC 組、MUT-LINC00472 +miR-NC 組（P均＜0.05），而MUT-LINC00472 + miR-136-3p 組、WT-LINC00472 + miR-NC 組、MUTLINC00472 + miR-NC 組兩兩比較P均＞0.05。WTPDCD4 + miR-136-3p 組熒光素酶活性為0.14 ±0.02，MUT-PDCD4 + miR-136-3p 組為0.92 ± 0.08，WT-PDCD4 + miR-NC 組 為0.98 ± 0.07，MUTPDCD4 + miR-NC 組 為0.96 ± 0.09，WT-PDCD4 +miR-136-3p組熒光素酶活性明顯低于MUT-PDCD4+miR-136-3p 組、WT-PDCD4 + miR-NC 組、MUTPDCD4 + miR-NC 組（P均＜0.05），而MUT-PDCD4 +miR-136-3p 組、WT-PDCD4 + miR-NC 組、MUTPDCD4+miR-NC組兩兩比較P均＞0.05。

表3 過表達miR-136-3p對LPS誘導后HK-2細胞miR-136-3p表達、細胞增殖活性、細胞凋亡率及培養上清液IL-6、IL-8水平和PDCD4蛋白表達的影響（±s）

表3 過表達miR-136-3p對LPS誘導后HK-2細胞miR-136-3p表達、細胞增殖活性、細胞凋亡率及培養上清液IL-6、IL-8水平和PDCD4蛋白表達的影響（±s）

注：與LPS+si-NC組比較，*P＜0.05。

組別LPS+miR-NC組LPS+miR-136-3p組miR-136-3p相對表達量0.21±0.02 0.86±0.06*細胞增殖活性（OD450值）0.55±0.03 1.23±0.07*細胞凋亡率（%）23.63±1.09 8.94±0.77*IL-6（ng/mL）27.45±1.07 6.64±0.71*IL-8（ng/mL）19.79±0.96 3.77±0.40*PDCD4蛋白相對表達量0.70±0.07 0.19±0.02*

表4 沉默lncRNA LINC00472并抑制miR-136-3p表達對LPS誘導后HK-2細胞miR-136-3p表達、細胞增殖活性、細胞凋亡率及培養上清液IL-6、IL-8水平和PDCD4蛋白表達的影響（±s）

表4 沉默lncRNA LINC00472并抑制miR-136-3p表達對LPS誘導后HK-2細胞miR-136-3p表達、細胞增殖活性、細胞凋亡率及培養上清液IL-6、IL-8水平和PDCD4蛋白表達的影響（±s）

注：與LPS+si-LINC00472+anti-miR-NC組比較，*P＜0.05。

組別LPS+si-LINC00472+anti-miR-NC組LPS+si-LINC00472+anti-miR-136-3p組miR-136-3p相對表達量0.79±0.06 0.29±0.02*細胞增殖活性（OD450值）1.14±0.07 0.61±0.05*細胞凋亡率（%）12.80±0.61 20.84±0.83*IL-6（ng/mL）9.74±0.68 23.75±0.84*IL-8（ng/mL）5.77±0.48 16.60±0.97*PDCD4蛋白相對表達量0.26±0.02 0.59±0.05*

圖1 lncRNA LINC00472、miR-136-3p和PDCD4的靶向結合位點示意圖

3 討論

急性腎損傷是由多種因素引起的，短期內腎功能急劇下降，從而導致的臨床綜合征。如果得不到及時有效治療，急性腎損傷很容易轉化為慢性腎功能不全，最終發展為慢性腎衰竭。但目前急性腎損傷的發病機制仍未完全闡明。

lncRNA是一類轉錄本長度超過200 nt的內源性非編碼RNA 分子，能夠參與機體多種生理和病理過程。有研究報道，lncRNA NEAT1可通過抑制LPS誘導 的HK-2 細 胞 炎 癥 反 應，減 輕 腎 臟 損 傷［8］；lncRNA HOTAIR 在膿毒癥誘導的腎損傷中表達上調，并可通過miR-22/HMGB1途徑促進腎小管上皮細胞凋亡，從而加重腎損傷［9］。這些研究表明lncRNA能夠參與急性腎損傷的發生、發展。LINC00472 作為lncRNA 家族成員，其表達下調可通過調節miR-373-3p/TRIM8 分子軸而減輕膿毒癥誘導的急性肝損傷［10］。lncRNA LINC00472 還能通過抑制miR-24 表達促進心房顫動發生［11］。但目前鮮見lncRNA LINC00472 異常表達與急性腎損傷關系的報道。本研究結果顯示，LPS 組lncRNA LINC00472 相對表達量明顯高于對照組，提示lncRNA LINC00472表達上調可能促進急性腎損傷發生。IL-6、IL-8是重要的促炎癥細胞因子。有研究報道，在LPS誘導的腎小管上皮細胞中IL-6、IL-8 水平明顯升高［12-13］。本研究結果發現，LPS 組培養上清液IL-6、IL-8 水平明顯高于對照組，進一步證實炎癥反應可參與急性腎損傷發生；而LPS+si-LINC00472 組培養上清液IL-6、IL-8 水平明顯低于LPS + si-NC 組，提示沉默lncRNA LINC00472 可抑制LPS 誘導的腎小管上皮細胞炎癥反應。炎癥反應可進一步促進細胞凋亡進而加重細胞損傷。本研究結果顯示，LPS組細胞增殖活性明顯降低，細胞凋亡率明顯升高，提示急性腎損傷后細胞增殖活性明顯降低而細胞凋亡明顯增加；而LPS+si-LINC00472組細胞增殖活性明顯升高，細胞凋亡率明顯降低，提示沉默lncRNA LINC00472 可促進LPS 誘導的腎小管上皮細胞增殖并抑制其凋亡。

本研究初步證實沉默lncRNA LINC00472 可通過促進LPS誘導的腎小管上皮細胞增殖并抑制其凋亡和細胞內炎癥反應，從而減輕急性腎損傷。但關于lncRNA LINC00472 的具體作用機制尚不清楚。miRNA 屬于內源性非編碼單鏈RNA分子，可通過特異性結合靶mRNA 的3′非編碼區抑制其翻譯或表達，進而調控細胞增殖、分化、凋亡等生物學行為。miR-136-3p 作為miRNA 家族成員，可通過靶向PTEN 改善酒精所致的骨量減少和骨質疏松［14］。本研究結果顯示，LPS 組miR-136-3p 相對表達量明顯低于對照組，提示miR-136-3p 表達下調與急性腎損傷發生有關；LPS + si-LINC00472 組miR-136-3p 相對表達量明顯高于LPS + si-NC 組，提示lncRNA LINC00472 與miR-136-3p 可能存在靶向調控關系。本研究經在線生物信息學網站預測顯示，lncRNA LINC00472與miR-136-3p存在靶向結合位點。進一步研究發現，LPS + miR-136-3p 組細胞增殖活性明顯高于LPS+miR-NC 組，細胞凋亡率且培養上清液IL-6、IL-8 水平明顯低于LPS+miR-NC 組，提示過表達miR-136-3p能夠減輕LPS誘導的腎小管上皮細胞損傷；LPS+si-LINC00472+anti-miR-136-3p 組細胞增殖活性明顯低于LPS + si-LINC00472 + anti-miRNC 組，細胞凋亡率且培養上清液IL-6、IL-8 水平明顯高于LPS + si-LINC00472 + anti-miR-NC 組，提示沉默lncRNA LINC00472 并抑制miR-136-3p 表達則可加重LPS誘導的腎小管上皮細胞損傷。

PDCD4 是近年新發現的一種腫瘤抑制因子。有研究表明，抑制PDCD4 表達能夠通過抑制腎小管上皮細胞凋亡而保護腎組織［15］。而沉默PDCD4 表達可減輕高糖誘導的血管內皮細胞氧化損傷［16］。miR-21 過表達則可通過靶向調控PDCD4 而抑制LPS 誘導的肺泡上皮細胞凋亡［17］。以上研究提示PDCD4 可能在急性腎損傷中發揮重要作用。本研究結果顯示，LPS 誘導的腎小管上皮細胞PDCD4 蛋白表達明顯升高，而沉默lncRNA LINC00472可明顯降低LPS 誘導的腎小管上皮細胞PDCD4 蛋白表達，miR-136-3p過表達同樣可降低LPS 誘導的腎小管上皮細胞PDCD4 蛋白表達，沉默lncRNA LINC00472并抑制miR-136-3p表達則可促進LPS誘導的腎小管上皮細胞PDCD4 蛋白表達；在線生物信息學網站預測顯示，PDCD4 是miR-136-3p 的靶基因。因此，抑制miR-136-3p表達可通過促進PDCD4蛋白表達，進而部分逆轉沉默lncRNA LINC00472 對LPS 誘導的腎小管上皮細胞損傷。

綜上所述，沉默lncRNA LINC00472可通過促進miR-136-3p 表達、抑制PDCD4 表達，從而減輕LPS誘導的腎小管上皮細胞損傷。