退變腰椎椎間盤髓核組織TNC、β-catenin和YAP1表達變化及其臨床意義

張強，劉曉飛，趙學軍

1 山東國欣頤養集團萊蕪中心醫院疼痛科，濟南271103；2 山東國欣頤養集團萊蕪中心醫院麻醉科；3 山東第一醫科大學附屬省立醫院疼痛科

隨著我國人口老齡化加劇和生活習慣改變，下腰痛的發病率逐年上升，并且其發病人群趨于年輕化［1］。目前，下腰痛的臨床治療策略以緩解疼痛的保守治療為主，如物理治療、藥物治療、腰肌功能鍛煉等。但這些治療方法均不能阻止、延緩或逆轉椎間盤退變，長期治療效果并不理想。有研究表明，約40%下腰痛與腰椎椎間盤退行性變（IDD）有關［2］。IDD 的發病機制復雜，涉及炎癥細胞浸潤、生物力學結構破壞、細胞外基質降解等，多種細胞因子和信號通路參與椎間盤損傷與修復［2］。腱糖蛋白C（TNC）是一種六聚體糖蛋白，在細胞黏附、成纖維細胞遷移以及組織重塑過程中發揮重要作用。有研究報道，TNC 能夠參與IDD 的病理生理過程［3］，但其具體機制尚不清楚。經典Wnt/β 連環蛋白（β-catenin）信號通路在胚胎發育、組織或器官形成、生長發育等生物學過程中扮演關鍵角色。Hippo/Yes 相關蛋白（YAP）信號通路是調控器官發育、維持細胞增殖與凋亡動態平衡的重要信號轉導通路，在調控骨代謝、維持骨穩態方面具有重要作用。有研究報道，經典Wnt/β-catenin 信號通路和Hippo/YAP 信號通路在IDD的病理生理過程中均發揮重要作用［4-5］。本研究探討了退變腰椎椎間盤髓核組織TNC、β-catenin、YAP1表達變化及其臨床意義?，F報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018年1月—2020年12月在山東國欣頤養集團萊蕪中心醫院收治的腰椎IDD患者46 例（觀察組）。其中，男27 例、女19 例，年齡32～61（50.11 ± 8.47）歲。納入標準：①符合腰椎IDD診斷標準且具有明確的手術指征；②保守治療3個月以上，臨床效果不明顯；③MRI檢查T2加權像顯示髓核呈不均勻的中等或低信號，椎間盤高度明顯下降，Pfirrmann Ⅲ級以上。排除標準：①合并脊柱先天畸形、感染、結核或腫瘤等原發性疾病者；②術前6周內行硬膜外或關節突關節注射治療者；③既往有腰椎手術史者；④語言表達障礙者；⑤妊娠期或哺乳期婦女。同期選擇因外傷所致腰椎骨折患者16 例（對照組），既往無下腰痛史或椎間盤手術史，術前影像學檢查提示不存在腰椎IDD或椎間盤突出等病變。其中，男9例、女7例，年齡28～58（44.88±8.55）歲。兩組性別、年齡具有可比性。本研究經山東國欣頤養集團萊蕪中心醫院醫學倫理委員會批準，所有研究對象知情同意并簽署書面知情同意書。

1.2 腰椎椎間盤髓核組織TNC、β-catenin、YAP1 表達檢測 觀察組經后外側椎板間開窗髓核摘除術或后路減壓植骨融合內固定術時獲取退變腰椎椎間盤髓核組織，對照組經后路內固定減壓椎間植骨融合術時獲取腰椎椎間盤髓核組織，將髓核組織用10%甲醛固定24 h，常規石蠟包埋，4 μm 厚連續切片。切片經65 ℃烤箱烤片2 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化。然后將切片置于枸櫞酸鹽抗原緩沖修復液中，高溫高壓抗原修復15 min，自然冷卻至室溫，PBS 沖洗5 min×3次。3%H2O2孵育10～15 min，以阻斷內源性過氧化物酶活性，然后正常山羊血清室溫封閉20 min，分別滴加TNC、β-catenin、YAP1 一抗，4 ℃孵育過夜。次日滴加生物素標記的二抗，37 ℃孵育30 min。DBA 顯色，蘇木素復染，常規脫水、透明，中性樹膠封固。以已知陽性組織切片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。

采用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析腰椎椎間盤髓核組織TNC、β-catenin、YAP1 表達情況。TNC 陽性染色定位于間質纖維組織，呈棕黃色顆粒狀；β-catenin 陽性染色定位于細胞膜和細胞質，呈棕黃色顆粒狀；YAP1 陽性染色定位于細胞質，呈棕黃色顆粒狀。每張切片隨機選取染色良好的5 個400 倍視野，記錄該區域面積和積分光密度，計算平均光密度。平均光密度為該區域積分光密度除以該區域面積。以平均光密度代表TNC、β-catenin、YAP1 相對表達量。連續測量3次，取平均值。

1.3 腰椎功能評價 腰椎IDD 患者術前采用Oswestry 功能障礙指數問卷表（ODI）評分［6］和日本骨科協會下腰痛（JOA）評分［7］評估腰椎功能。ODI包括疼痛（疼痛程度、疼痛對睡眠的影響）、單項功能（提/攜物、坐、站立、行走）和個人綜合功能（日常活動能力、性生活、社會活動和郊游）三個維度10個條目，每個條目評分0～5 分，總分0～50分。ODI評分越高，腰椎功能障礙越嚴重。JOA 評分包括主觀癥狀（下腰痛、腿痛、步態）、臨床體征（直腿抬高、感覺障礙、運動障礙）、日?；顒邮芟薅群桶螂坠δ芩膫€維度，總分0～29 分。JOA 評分越低，腰椎功能障礙越嚴重。

1.4 統計學方法 采用SPSS20.0 統計軟件。服從正態分布且方差齊性的計量資料以±s表示，結果比較采用獨立樣本t檢驗。相關性分析采用Pearson相關分析法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組腰椎椎間盤髓核組織TNC、β-catenin、YAP1表達比較 見表1。

表1 兩組腰椎椎間盤髓核組織TNC、β-catenin、YAP1相對表達量比較（±s）

表1 兩組腰椎椎間盤髓核組織TNC、β-catenin、YAP1相對表達量比較（±s）

組別觀察組對照組t P n 46 16 TNC 0.15±0.03 0.11±0.02 5.936＜0.05 YAP1 0.26±0.04 0.20±0.03 5.342＜0.05 β-catenin 0.31±0.04 0.23±0.03 8.066＜0.05

2.2 退變腰椎椎間盤髓核組織TNC、β-catenin、YAP1 表達的關系 退變腰椎椎間盤髓核組織TNC表達與β-catenin、YAP1表達均呈正相關關系（r分別為0.543、0.574，P均＜0.05），而β-catenin 表達與YAP1表達亦呈正相關關系（r=0.360，P＜0.05）。

2.3 退變腰椎椎間盤髓核組織TNC、β-catenin、YAP1表達與ODI、JOA評分的關系 腰椎IDD患者ODI評分為（38.39 ± 5.13）分、JOA 評分為（13.30 ± 2.80）分，其退變腰椎椎間盤髓核組織TNC、β-catenin、YAP1表達與ODI 評分均呈正相關關系（r分別為0.674、0.444、0.398，P均＜0.05），與JOA評分均呈負相關關系（r分別為-0.589、-0.415、-0.361，P均＜0.05）。

3 討論

腰椎IDD是引起下腰痛的常見原因。髓核組織位于椎間盤中央，能夠抵抗施加在脊柱上的壓縮負荷。髓核組織被破壞是導致IDD 的重要原因，隨著髓核細胞數量減少，其分泌的細胞外基質減少，加重了椎間盤組織退變，這可能是IDD 的病理生理學基礎［8］。雖然機械壓迫、衰老、遺傳和自身免疫等已在不同的動物模型中被證實可誘導IDD 發生，但IDD細胞事件的潛在分子機制仍不清楚。

TNC 是Tenascins 家族中第一個被發現的成員，其基因定位于人9號染色體長臂3區3帶，包含27個內含子和30 個外顯子，編碼蛋白是一種具有六臂體結構的細胞外基質蛋白。正常情況下，TNC 是一種主要在胚胎發育過程中表達的細胞外基質蛋白，如骨骼形成、神經發育或血管生成，而在發育成熟組織中不表達或極少表達［9］。有研究報道，TNC 表達受機械應力調節，在高應力組織中表達明顯增加［9］。丁萌萌等［3］對人和小鼠的椎間盤髓核組織研究發現，在炎癥因子刺激下，TNC在椎間盤組織中表達顯著升高，引入外源性TNC 后，可抑制基質金屬蛋白酶表達，結果證實TNC 對椎間盤組織具有保護作用。WANG 等［10］利用家兔構建體外類風濕關節炎模型，同樣發現TNC 在IL-1β 誘導的炎癥組織中表達增加。本研究結果發現，觀察組腰椎椎間盤髓核組織TNC 表達明顯高于對照組，并且其表達與腰椎IDD 患者ODI、JOA 評分均呈正相關關系。提示TNC可能在腰椎IDD 的病理生理過程中具有重要作用，與NAKOSHI等［11］報道一致。

Wnt/β-catenin 信號通路可分為經典的Wnt/βcatenin 信號通路和非經典的Wnt/β-catenin 信號通路，在維持胚胎發育、組織穩態等方面具有重要作用。β-catenin 為經典Wnt/β-catenin 信號通路的核心蛋白，是一種共轉錄激活因子。Wnt 活化后，Wnt3a 配體通過與細胞膜上特異性受體LRP5/6 結合，促使細胞質內GSK3β、Axin 等與β-catenin 形成的復合物分解，β-catenin由細胞質進入細胞核，激活整個信號通路［4］。Wnt/β-catenin信號通路在軟骨細胞增殖與分化、軟骨形成與化生等過程中具有重要作用，還能參與細胞外基質代謝調控。近年研究發現，在病理狀態下，Wnt/β-catenin信號通路可通過抑制細胞外基質合成，介導細胞凋亡和炎癥反應，進而在軟骨細胞退化過程中發揮重要作用［12］。HIYAMA等［12］研究發現，激活Wnt/β-catenin 信號通路可促使椎間盤細胞衰老和凋亡。ZHAN 等［13］研究發現，長鏈非編碼RNA HOTAIR 可通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進髓核細胞衰老、凋亡和細胞外基質降解，進而加速IDD這一病理過程。本研究結果發現，觀察組腰椎椎間盤髓核組織β-catenin 表達明顯高于對照組，并且其表達與腰椎IDD 患者ODI、JOA 評分均呈正相關關系。提示Wnt/β-catenin 信號通路可能參與IDD的病理生理過程。

Hippo 信號通路是一種進化保守的信號傳導通路，在細胞增殖、分化和凋亡過程中具有關鍵作用。YAP1 是Hippo 信號通路的關鍵轉錄輔激活因子和負調節因子，其本質上是一種共激活因子。當Hippo信號通路激活后，YAP/TAZ 復合物被磷酸化，導致其滯留在細胞質內而被降解；當Hippo 信號通路關閉后，YAP/TAZ 進入細胞核內發揮轉錄作用。既往研究發現，Hippo 信號通路與椎間盤組織的自然退變有關，如大鼠椎間盤YAP 蛋白隨著鼠齡增長逐漸降低［5］。近年研究發現，YAP 是一種關鍵的機械轉導因子，機械應力可激活YAP表達，提示Hippo信號通路與細胞骨架在細胞機械轉導過程中具有生物學相關性［14］。但在椎間盤退變過程中YAP與細胞骨架的關系尚不清楚。CHEN等［15］研究發現，在IL-6介導的椎間盤損傷小鼠髓核細胞中YAP1 表達顯著升高，而使用YAP1 特異性抑制劑維替泊芬能夠有效緩解大鼠椎間盤IDD 進展。本研究結果發現，觀察組腰椎椎間盤髓核組織YAP1 表達明顯高于對照組，并且其表達與腰椎IDD 患者ODI、JOA 評分均呈正相關關系。提示Hippo 信號通路可能在IDD 的病理生理過程中發揮重要作用。

本研究結果表明，TNC、β-catenin、YAP1 均參與IDD 的病理生理過程，但其相互作用機制尚不完全清楚。陳昱等［16］研究發現，在小鼠去卵巢骨質疏松模型中，下調TNC表達可增強DKK-1表達，進而抑制Wnt/β-catenin 信號通路活性，導致成骨細胞分化減少。有研究發現，在神經內分泌腫瘤和急性腎損傷組織中，TNC 同樣可通過激活Wnt/β-catenin 信號通路調節腫瘤和腎損傷微環境［17-18］。本研究結果發現，退變腰椎椎間盤髓核組織TNC表達與β-catenin表達呈正相關關系，證實TNC 有可能通過Wnt/β-catenin信號通路影響IDD 進展。LI 等［19］研究發現，在強直性脊柱炎中TNC 可通過激活Hippo 信號通路，刺激病理性新生軟骨生長，而且免疫組化染色顯示，磷酸化的YAP 蛋白在患者脊髓韌帶組織TNC 高度聚集部位表達增加。本研究結果亦發現，退變腰椎椎間盤髓核組織TNC 表達與YAP1 表達呈正相關關系，證實TNC 亦能通過Hippo 信號通路影響IDD 進展。有研究證實，Hippo 信號通路與Wnt/β-catenin 信號通路存在交叉聯系，YAP 可能在其中起到關鍵作用，并且與β-catenin 形成轉錄復合物調節這兩個信號通路的激活狀態［20］。本研究結果發現，退變腰椎椎間盤髓核組織YAP1 表達與β-catenin 表達呈正相關關系，提示YAP1 與β-catenin 的相互作用能夠誘導IDD進展［15］。

綜上所述，退變腰椎椎間盤髓核組織TNC、β-catenin、YAP1表達升高，三者可能共同參與腰椎IDD的病理生理過程。TNC可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路和Hippo信號通路而參與髓核組織退變。但本研究僅為組織學研究且樣本數量有限，后續將進一步在分子層面上探索三者在IDD病理生理過程中的作用機制。