高產己酸梭狀芽孢桿菌的誘變及篩選育種

屈 慧，王海英，王 慧，徐 芳，屈 宇，郝禎燕

（1.河套酒業集團股份有限公司技術中心，內蒙古巴彥淖爾 015400；2.臨河區人民醫院，內蒙古巴彥淖爾 015000；3.臨河區動物疫病預防控制中心，內蒙古巴彥淖爾 015000）

己酸菌是窖泥中的主要功能性微生物，而窖泥在北方濃香白酒發酵中起到了舉足輕重的作用。故己酸菌在白酒發酵中享有不可或缺的地位。

己酸菌就本身特性而言屬于比較“嬌氣”型菌種，在發酵的過程中對發酵條件的要求比較嚴苛，且具有自身容易老化衰退、種間差異性較大等特點。這就需要科研人員對己酸菌進行持續的、更加深入的研究。

針對己酸菌以上特性，選擇實驗室保藏菌種209#己酸菌作為出發菌株，采取物理和化學相結合的方法進行誘變，篩選出發生正向突變的菌株。同時對篩選到的菌株進行遺傳性狀穩定性的檢測和代謝產物變化規律的跟蹤分析。確保誘變后的菌種遺傳性狀穩定，產物代謝規律清晰。作為生產使用菌種應用到大生產中，以達到提高釀酒材料中己酸乙酯的目的。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 菌種

實驗室保藏菌種209#己酸菌。

1.1.2 培養基

巴氏（改良）培養基：無水乙酸鈉0.5%、酵母浸粉0.4 %、硫酸銨0.05 %、磷酸氫二鉀0.04 %、硫酸鎂0.02%、酒精2%、碳酸鈣1%、pH 值6.5～7.0、蒸餾水1000 mL。121 ℃高壓滅菌30 min。（備注：碳酸鈣干熱滅菌，酒精在接種前加入。）

己酸菌富集培養基：氯化鎂200 mg、硫酸錳2.5 mg、硫酸亞鐵5 mg、生物素5 μg、乙酸鈉8 g、氯化銨500 mg、硫酸鈣10 mg、鉬酸鈉2.5 mg、對氨基苯甲酸100 μg、乙醇25 mL、營養瓊脂20 g、蒸餾水1000 mL。pH 值自然，121 ℃滅菌20 min，冷卻后無菌加入25 mL乙醇。

車間生產工藝培養基：三水醋酸鈉1.5%、酵母粉0.6%、硫酸銨0.05%、磷酸氫二鉀0.04%、硫酸鎂0.02 %、土1.5 %、酒精2 %、碳酸鈣0.5 %、pH 值自然、純凈水1000 mL；罐體及物料蒸汽滅菌30 min。酒精接種時加入，34 ℃培養7 d。

1.1.3 儀器設備

電子天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）、生物安全柜（蘇州市金凈凈化設備科技有限公司）、奧林巴斯BX51 顯微鏡（奧林巴斯（北京）銷售服務有限公司）、數顯電熱恒溫培養箱（上海博迅實驗有限公司）、醫用冷藏箱（中科美菱低溫科技有限責任公司）、立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）、YQX 型厭氧培養箱（上海躍進醫療器械廠）、島津GC-8A 氣相色譜儀、單道可調量程移液槍（普德蘭上海貿易有限公司）等儀器。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化

1.2.1.1 菌種復壯

對保藏菌種209#己酸菌進行熱處理。處理條件為80 ℃，水浴振搖處理10 min，冷卻至室溫后轉接于新鮮富集培養基中，34 ℃培養5～7 d。

1.2.1.2 菌種繼代培養

對復壯的菌種進行2 次繼代培養。培養基使用巴氏改良培養基，34 ℃培養5～7 d。讓菌種活力和健壯程度達到最佳，菌體濃度達到×10。

1.2.2 菌種誘變

1.2.2.1 紫外線誘變

1.2.2.1.1 菌懸液制備

吸取5 mL 菌液，5000 r/min，離心10 min，棄去上清液，加入5 mL 生理鹽水振蕩均勻后再離心棄去上清液，如此反復2 遍。第3 遍時加入5 mL 生理鹽水充分振蕩均勻待用（備注：菌液洗脫需在超凈工作臺中操作）。

1.2.2.1.2 誘變條件

19 W紫外燈、波長245 nm、照射距離38 cm、照射時間2 min、4 min、6 min。

1.2.2.1.3 誘變步驟

誘變前采用平板計數法對制備好的菌懸液進行菌落計數，將1.2.2.1.1 制備好的菌懸液倒入φ=90 mm 的無菌平皿中，使用無菌接種環將其均勻涂開，使液體平鋪于皿中，提前15 min 預熱的紫外燈垂直照射于菌液。在整個誘變過程中不能照射白熾光。誘變后吸取1 mL 菌液用于菌落計數，其余菌液全部轉接于10 mL 具塞試管中，加入新鮮巴氏改良液體培養基，34 ℃密封、避光培養5～7 d。誘變后菌種需進行3～4 次繼代培養，培養結束后待用。

1.2.2.1.4 誘變后菌種分離

平板傾注法：在無菌條件下吸取1 mL 1.2.2.1.3中的待用菌液，進行梯度稀釋，選擇10～10梯度進行平板轉接。將提前高壓滅菌的己酸菌富集培養基傾注于平皿中，充分搖勻。凝固后倒置于厭氧培養盒中，34 ℃密封避光培養4～5 d。

挑取單菌落：選擇形態獨立的菌落進行挑取，轉接入5 mL 具塞試管中，加入巴氏改良培養基，34 ℃密封避光培養7 d。

1.2.2.1.5 代謝產物檢測

樣品處理：吸取1 mL己酸菌液，加入0.1 mL 甲酸酸化處理，加入50%的乙醇溶液定容到10 mL，充分振蕩40 s，過0.22μm 濾膜后，注入1.5 mL 樣品瓶中，上氣相色譜檢測。色譜條件：色譜柱CP-Wax57 CB（50 m 長，內徑0.25 mm，膜厚0.2 mm）；柱溫采用程序升溫，初始溫度為50 ℃，保持2 min，升溫速率為15 ℃/min，終止溫度為230 ℃，保持15 min；進樣器溫度為150 ℃，檢測器溫度為250 ℃；載氣（高純氮）流速為44 mL/min，氫氣流速為30 mL/min，空氣流速為400 mL/min；進樣量為1μL。

1.2.2.2 氯化鋰誘變

1.2.2.2.1 出發菌株

以紫外線誘變分離得到的正突變菌株為出發菌株，進行氯化鋰誘變。

1.2.2.2.2 誘變方法

誘變菌體為新鮮、健壯且菌體濃度為10個/mL。將該菌以10 倍稀釋梯度進行稀釋，選擇最適稀釋梯度分別傾注于氯化鋰添加量為0.3 %、0.6 %、0.9%、1.2%、1.5%的巴氏（改良）培養基平板中，培養條件為34 ℃下避光、倒置培養5 d。

1.2.2.2.3 菌種分離

挑取獨立形態較好的單菌落，轉接于5 mL具塞試管中，培養基使用巴氏改良液體培養基，密封、避光培養5～7 d。逐級擴大培養，同時跟蹤檢測代謝產物，方法同1.2.2.1.5。

1.2.3 誘變菌種組合及應用

為了增加己酸菌液的復合香氣，決定將誘變得到的3株菌種，兩兩組合后轉接于己酸車間800 kg不銹鋼罐中，同步培養，7 d檢測代謝產物。生產工藝及培養基如前所述，代謝產物檢測方法同1.2.2.1.5。

2 結果與分析

2.1 紫外線誘變結果

2.1.1 紫外線誘變致死率計算

通過對誘變前后菌種進行活體平板計數，計算其致死率，確定最適誘變時間。

結合表1 分析，紫外線誘變致死率在其他參數不變的情況下，隨著誘變時間的延長，菌種致死率升高。有研究認為，紫外線誘變致死率在70 %～80 %或者更低時，菌種發生正向突變的幾率更大。由表1 可知，誘變時間為2 min 時，致死率為71.13%，在最適致死率范圍之內。誘變時間為4 min和6 min時的致死率超出最適致死率范圍。故紫外線最適誘變時間確定為2 min。

表1 誘變后活體致死率

2.1.2 誘變后菌種分離結果

對誘變后的菌種進行梯度稀釋，選擇10～10梯度轉接，每梯度吸取1 mL 注入無菌平皿中，加入15～20 mL 己酸菌富集瓊脂培養基，充分混勻后，冷卻凝固。倒置于厭氧盒中，放入厭氧包及厭氧指示劑，密封，34 ℃培養5～7 d。挑取36 個獨立的單菌落分別轉接于5 mL 具塞試管中，加入巴氏（改良）液體培養基，密封，避光培養7～10 d。使用1.2.2.1.5方法檢測其代謝產物。對照菌株己酸含量為635 mg/100 mL。36 株菌種中，有1 株高于對照，己酸含量為704 mg/100 mL，其余35 株己酸含量均低于100 mg/100 mL。菌種突變率見表2。

表2 分離菌種突變率統計

發生正向突變菌株，菌落小且成圓形，邊緣整齊，乳白色。根據其菌落形態命名為XYD1#己酸菌。該菌傳代培養5 代后，作為出發菌株進行氯化鋰誘變。

2.2 氯化鋰誘變結果

選取XYD1# 5 代菌種，菌落平板計數和氯化鋰平板復誘變同時進行。氯化鋰用量分別為0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%、1.8%。不同氯化鋰濃度致死率見表3。

表3 氯化鋰致死率

結合表3分析，隨著氯化鋰濃度的增加，菌種致死率升高，其中添加量為1.5%時致死率為100%。最適誘變條件為氯化鋰添加量0.9%。選擇致死率為76.88%的平板進行單菌落分離。共挑取28個單菌落，分別轉接于5 mL巴氏改良培養基中密封培養10 d，檢測其代謝產物。其中編號為Y18、Y28兩株菌種己酸含量高于出發菌株XYD1#，發生正向突變，己酸分別為786 mg/100 mL、803 mg/100 mL；Y11、Y19己酸含量分別為632 mg/100 mL、648 mg/100 mL，接近對照，沒有發生突變；其余24 株菌種均低于100 mg/100 mL，發生負突變。菌種突變率見表4。

表4 氯化鋰誘變菌種突變率統計

2.3 誘變菌種代謝產物變化規律

對誘變得到的XYD1#、Y18、Y28 3株菌種同步培養，通過連續7 d取樣檢測其代謝產物，了解每株菌種的代謝產物變化規律。

結合圖1 分析，乙酸、丁酸、己酸三大酸在7 d內呈現出此消彼長的趨勢。乙酸在培養第2 天時達到最大值，之后一直降低，第5～7 天時基本趨于平穩；丁酸和己酸走勢趨于一致，只是增加和降低的幅度較小；己酸在培養前3 d 時產量基本處于平穩狀態，從第4天開始己酸翻倍增加，到第7天時己酸達到最大值1127 mg/100 mL。

圖1 XYD1#7 d代謝產物變化趨勢

結合圖2 分析，乙酸、丁酸、己酸三大酸在7 d內仍然是此消彼長的趨勢。乙酸在第2 天時達到最大值，之后逐漸降低，第7 天達到最低值。丁酸和己酸走勢趨于一致，只是增加和降低的幅度較小；己酸在培養前3 d時產量基本處于平穩狀態，從第4 天開始己酸翻倍增加，到第7 天時己酸達到最大值1362 mg/100 mL。

圖2 Y18的7d代謝產物變化趨勢

結合圖3 分析，乙酸、丁酸、己酸三大酸在7 d內仍然是此消彼長的趨勢。乙酸在前3 天略有降低，第4～5天時達到最大值，之后逐漸降低，第7天降到最低值。丁酸和乙酸變化趨勢一致，只是在第4～6 天時丁酸的增長幅度較大；己酸在培養前3 d時略有降低，從第4天開始己酸翻倍增加，到第7天時己酸達到最大值1286 mg/100 mL。

圖3 Y28的7 d代謝產物變化趨勢

通過將XYD1#、Y18、Y28 3株誘變菌株同步培養，發現二次誘變得到的Y18、Y28 兩株菌種在產己酸方面較XYD1#有所提升，達到了二次誘變的效果。

2.4 誘變菌種組合篩選

3 株誘變菌種兩兩等比例組合，同步培養7 d，取樣檢測代謝產物結果見表5，復合香味見表6。

表5 3株誘變菌種兩兩等比例組合7 d代謝產物(mg/100 mL)

表6 3株菌種組合后復合香氣鑒定表

結合表5 分析，組合之后的菌種己酸產量依次是F1＞F3＞F2。而且F1 己酸產量均高于Y28 和XYD1#兩株單菌種。說明組合菌種在產己酸方面是相互促進的。各方案己/丁比值仍然是F1＞F3＞F2，說明F1丁酸轉化己酸較F2、F3更加徹底。

結合表6 分析，F1、F3 復合香氣較F2 濃郁。F1、F2、F3均無異雜味。

結合代謝產物和感官鑒定綜合分析，組合之后的菌種無論是己酸產量還是復合香氣方面都優于單一菌種，而且組合之后的F1要優于F2、F3。

3 結論

3.1 試驗室己酸菌種209#經過復壯后進行紫外線誘變，設計不同試驗方案摸索紫外線誘變最佳條件。通過檢測菌種致死率，確定209#己酸菌最適誘變條件為：19 W 紫外燈、波長245 nm、照射距離38 cm、照射時間2 min。

3.2 紫外線誘變后菌種采用平板厭氧分離，得到36 株單菌株。通過對其代謝產物檢測篩選得到1株正突變菌株，命名為XYD1#。

3.3 利用XYD1#為出發菌株，設計不同濃度的氯化鋰添加方案進行二次誘變，誘變后采用平板厭氧分離計數。氯化鋰添加量為0.9%的誘變方案致死率為76.92%，為最適誘變方案。分離得到28 株單菌株，通過檢測代謝產物，篩選得到兩株正突變菌株，命名為Y18和Y28，己酸產量分別為786 mg/100 mL、803 mg/100 mL；兩株未突變菌株命名為Y11、Y19，己酸產量為632 mg/100 mL、648 mg/100 mL，與出發菌株XYD1#接近；24 株負突變菌株，己酸產量均低于100 mg/100 mL。

3.4 選取XYD1#、Y18、Y28 3 株正突變菌株進行同步培養，通過逐天跟蹤其代謝產物，繪制出3 株菌種的代謝產物變化圖。了解各菌株代謝產物變化規律，摸索其生長規律，利于后期培養應用。

3.5 將XYD1#、Y18、Y28 3 株菌種進行兩兩等比例混合，同時應用到己酸生產車間800 kg 不銹罐中，同步培養7 d。通過分析代謝產物產量及結構，結合香氣鑒定，最終確定F1 為最優組合（即Y28∶XYD1#=1∶1），可應用于車間生產，為提高原酒中己酸乙酯含量提供菌種保障。