全自動固相萃取-氣相色譜質譜聯用測定釀造用水中的20種農藥殘留

黃 箭，謝正敏，安明哲，魏金萍，張 倩，薛潤萍

（宜賓五糧液股份有限公司，四川宜賓 644000）

我國是農業大國，是生產和使用農藥最多的國家。隨著農業的發展，農藥被廣泛應用于現代農業的生產中，常見的農藥種類包括有機氯、有機磷、擬除蟲菊酯類以及氨基甲酸酯類等，其作用是消滅、控制或預防危及農業的病、蟲害、雜草等有害物質。我國每年使用農藥高達上百種，使用量高達百余萬噸，但只有30 %左右的農藥能夠被利用，大量未被利用的農藥通過降雨、地表徑流等方式進入水環境污染水源，對生態環境和人類健康帶來潛在的危害。據相關文獻報道，水環境中主要農藥污染物為有機氯農藥（organochlorine pesticides，OCPs）和有機磷農藥（organophosphorus pesticides，OPPs）。Pan 等調查發現長江流域中間段地下水中農藥含量OCPs 含量最高；Gao 等對我國淡水流域地表水中農藥殘留調查發現OPPs 含量高于OCPs。研究表明，水環境中主要OCPs 是六六六（hexachlorocyclohexane，HCH）和滴滴涕（dichlorodiphenyltrichloroethane，DDT）。農業部自頒布《到2020 年農藥使用量零增長行動方案》后，OPPs 的施用量雖有所下降，但是敵敵畏、毒死蜱和馬拉硫磷等OPPs 每年的使用量仍達到1000～30000 t，導致水環境中不斷有OPPs檢出。

古人云“水乃酒之魂”，水是酒的主要成分之一，不管是利用傳統技術釀酒還是現代新工藝技術釀酒，水質決定了酒質，水質的好壞直接影響著酒的質量。所謂名酒產地，必有佳泉，傳統經驗認為只有潔凈的泉水才能釀出醇香的美酒，許多名優酒廠均選建在有良好水源的地方。釀造用水中所含的各種成分，都與微生物的生長、酶的形成、糟醅的發酵以及成品酒的質量息息相關。水中的農藥殘留會對白酒的食品安全造成潛在的風險，因此建立釀造用水中農藥殘留的檢測方法至關重要。

目前，國內外對農藥殘留的檢測方法有很多，主要有氣相色譜法（gas chromatography，GC）、氣相色譜質譜法（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）和液相色譜質譜聯用法（liquid chromatography mass spectrometry，LC-MS）。水環境中農藥殘留檢測最常用的前處理方法有液液萃取（liquid liquid extraction，LLE）和固相萃取（solid phase extraction，SPE）。液液萃取通常需要使用大量的有機溶劑，且對環境污染較大，樣品的重現性較差；固相萃取可以將農藥的萃取、濃縮、選樣等多種功能技術匯集于一體，從而大幅度地優化和提升萃取工作效率，同時溶劑使用量少，有利于實現自動化和標準化。由于水中農殘的含量較低，通常選用固相萃取來對水中的農藥殘留進行富集、濃縮來提高目標物的檢出限。實驗采用全自動固相萃取方式進行前處理，并進一步優化實驗條件，建立氣相色譜-質譜聯用對釀造用水中20 種農藥殘留的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

農藥標準品：敵敵畏、α-六六六、樂果、呋喃丹、β-六六六、γ-六六六、五氯硝基苯、δ-六六六、甲基對硫磷、七氯、馬拉硫磷、艾氏劑、毒死蜱、對硫磷、狄氏劑、P,P'-滴滴涕（P,P'-DDT）、異狄氏劑、O,P'-滴滴涕（O,P'-DDT）、P,P'-滴滴伊（P,P'-DDE）、P,P'-滴滴滴（P,P'-DDD），質量濃度為100 μg/mL 的單標準溶液,北京海岸鴻蒙標準物質技術有限責任公司。

試劑：乙酸乙酯（色譜純），賽默飛世爾科技有限公司；二氯甲烷（色譜純），西隴化工股份有限公司；正己烷（色譜純），甲醇（色譜純），德國Merck 公司；CNWBOND LC-C柱（500 mg/6 mL），Poly-Sery HLB Pro 柱（200 mg/6 mL），上海安譜實驗有限公司；無水硫酸鈉，成都科隆化學品有限公司。

儀器設備：7890B-7000C 氣相色譜質譜聯用儀，安捷倫科技有限公司；Fotector plus60 全自動固相萃取儀，AUTO EVA60 全自動濃縮儀，睿科儀器有限公司；milli-Q純水機,密理博有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 農殘混合標液的配制

準確量取質量濃度為100 μg/mL 的有機磷、呋喃丹、狄氏劑、異狄氏劑各200 μL，其余農藥各100 μL于10 mL的棕色容量瓶中，加入乙酸乙酯定容，混勻后得部分農殘質量濃度為2 μg/mL，其余為1 μg/mL 的混合標準儲備液。混合標準工作液的配制：采用逐級稀釋法配制不同濃度的農殘混合標準工作液，用空白基質將農殘混標儲備液稀釋成1 μg/L、3 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、25 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L的混合標準工作液。

1.2.2 氣相色譜-質譜條件

氣相色譜條件：HP-5MS 毛細管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；載氣為氦氣（純度≥99.999 %），流速1 mL/min；進樣方式：不分流進樣；進樣量：1 μL；柱溫：起始溫度60 ℃，保持1 min，以25 ℃/min 升至180 ℃，保持0.5 min，以2 ℃/min 升至190 ℃，1 ℃/min 升至195 ℃，再以5 ℃/min 升至230 ℃，最后以20 ℃/min 升至280 ℃，保持2 min；進樣口溫度：250 ℃；輔助加熱溫度280 ℃。

質譜條件：采用EI多反應監測模式（MRM），溶劑延遲：5 min，離子源溫度：230 ℃，四級桿1 溫度：150 ℃，四級桿2溫度：150 ℃，碰撞氣為高純氮氣。

1.2.3 水樣前處理

體育旅游以其較強的參與性、靈活性和娛樂性等特點，延伸出紛繁多彩的新形式。而傳統的觀光旅游也正在逐步向體驗式旅游轉變[1]，體育賽事活動、體育場（館）服務業、體育健身休閑以及體育用品制造等與旅游產業相結合，形成“賽事型體育旅游”“運動休閑型體育旅游”等特定形式的體育旅游地。當前，我國體育特色小鎮正以“體育+旅游”的主要模式蓬勃發展。

將取回的水樣置于棕色玻璃瓶中，按照水樣∶甲醇=100∶1 的比例在水中加入甲醇作為穩定劑。待測水樣用0.25 μm 濾膜過濾，置于4 ℃冰箱中保存，于7 d 內進行萃取。取經過濾后的水樣500 mL以10 mL/min的速度通過HLB萃取柱。水樣萃取完成后，用氮氣吹干SPE小柱，用10 mL乙酸乙酯-二氯甲烷（1∶1）分兩次淋洗（詳情見表1），再用5 mL 乙酸乙酯-二氯甲烷（1∶1）潤洗樣品瓶，合并洗脫液，用無水硫酸鈉除水后氮吹至近干，用混合液定容至1 mL，待儀器測定。

表1 全自動固相萃取流程

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

由于化合物的種類較多，各化合物對質譜的響應差別較大，根據目標農殘在質譜上響應的差異，首先配制高濃度的農殘混合標樣進行質譜全掃描分析，確定各物質的保留時間后，逐個分析其質譜圖，比較每一種化合物產生的碎片離子的相對豐度，選擇豐度較高、干擾較小的離子作為母離子進行子離子掃描，優化對應的電離能，在不同的電離情況下確定各個化合物響應最佳的碎片離子，選擇響應較好的兩個子離子作為定量離子和輔助定性離子，通過以上方法確定20 種目標農殘的MRM 離子對信息，見表2，實驗為使各農殘在質譜上響應強度相近，配制了不同濃度的混合標準溶液，由此獲得的質譜圖見圖1，圖1 有機磷、呋喃丹、艾氏劑、狄氏劑配置為20 μg/L，其余農藥為10 μg/L 的混合標準溶液。

圖1 20種農藥標樣的MRM圖

表2 20種農藥的保留時間及離子對參數

2.2 固相萃取條件的優化

2.2.1 固相萃取柱的選擇

固相萃取柱的萃取效率對樣品的檢測極為重要，決定萃取效果的是SPE 小柱填充劑的類型、上樣速度以及洗脫溶劑的種類及流速，本研究所需富集的目標農殘主要為有機氯和有機磷兩類，有機氯基本都是非極性化合物，有機磷多為中等級性化合物，根據目標農殘的類型，方法選用C柱和HLB柱，均為反相柱，適用于非極性至中等極性的化合物的富集。由圖2 可知，C柱對20 種農殘的回收率范圍為29.4 %～114.11 %，平均回收率為93.81 %；HLB 小柱對20 種農殘的回收率范圍為55.91 %～102.31 %，平均回收率為87.64 %。其中樂果回收率HLB 柱可達95.51 %，C柱為29.4 %，這與有關研究的C對水中樂果的回收率高達80%以上不符，艾氏劑的回收率只有60%左右，其他回收率均在70%～110%之間，且兩根小柱的回收率相差不大。為保證多數農殘的回收率，選擇HLB小柱為萃取小柱。

圖2 不同小柱對目標農殘的回收率比較

2.2.2 洗脫液的選擇

圖3 不同混合溶劑對目標農殘洗脫效率的影響

2.2.3 水樣pH值的選擇

據相關文獻報道，有機磷農藥在中性或酸性條件下較穩定，在堿性條件下易發生降解，研究將水樣pH 值用鹽酸調節至2～3，同時對照組不調節pH值，采用全自動固相萃取儀對水樣進行富集，經洗脫、濃縮后進行檢測。結果表明，水樣pH 值對目標農殘的回收率影響較小，將水樣pH 值調至酸性對回收率并沒有較大的改善作用。

2.3 基質效應

基質效應的存在會對目標組分的信號產生增強或者抑制效應，基質效應（ME=B/A，A 為純溶劑中農藥的響應值，B 為樣品基質中添加的相同含量農藥的響應值）比值在0.9 和1.1 之間，表示基質效應可以忽略，大于1.2 為基質效應增強，小于0.9 為基質效應減弱。研究用經mili-Q 處理過的超純水進行加標實驗，發現基質效應對部分農殘回收率的影響較大，均為基質增強效應，分別計算了用基質配標和溶劑配標的回收率，見圖4—圖5。結果表明，若用溶劑配標去計算樣品加標回收率，結果普遍高于100 %，其中樂果、呋喃丹、馬拉硫磷、異狄氏劑的回收率均大于120%，呋喃丹回收率達200%以上，馬拉硫磷回收率高達180%，其他農殘的基質效應可以忽略，而用基質配標回收率均在70 %～110 %之間。趙麗在對生活飲用水中14種農藥殘留檢測中用C8、PEP柱進行加標回收時部分農殘回收率高達300%，這是忽略了基質效應對農藥的影響，因此用基質配標進行加標回收的計算更為準確。

圖4 溶劑配標和基質配標的色譜對比圖

圖5 基質配標和溶劑配標對加標樣回收率的影響

2.5 回歸方程、線性范圍和檢出限

取標準系列溶液按上述條件進行進樣分析，分別以每種標樣的濃度（x，μg/L）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標繪制標準曲線。結果顯示，在1～200 μg/L 范圍內20 種農藥線性良好，相關系數R≥0.993。方法的檢出限（limit of detection，LOD）以3倍信噪比（S/N=3）計算，定量限（limit of quantitation，LOQ）以S/N=10計算，結果見表3。

表3 20種農殘的線性回歸方程、相關系數(R2)、檢出限和定量限

2.6 加標回收率

在500 mL 空白水樣中加入目標農殘，添加濃度分別為50 ng/L、100 ng/L、200 ng/L，每個濃度水平平行6 次，按優化條件處理并分析水樣，回收率及精密度見表4。除七氯和艾氏劑外，其他18 種農殘平均回收率在81.57 %～115.91 %之間，RSD 在4%～13%之間，均在允許偏差內。

表4 不同加標水平的回收率和相對標準偏差RSD(%，n=6)

2.7 樣品檢測

采用優化后的參數對車間釀酒用水進行農殘檢測，除敵敵畏、α-六六六、呋喃丹、γ-六六六、δ-六六六、對硫磷以外，其余農殘均有檢出，含量為0.003～0.021 μg/L，均低于國標限量標準。

3 結論

本研究通過全自動固相萃取-氣相色譜質譜聯用儀，建立了釀造用水中20 種常見農殘檢測方法。在擬定的實驗條件下，20種農藥得到了較好的分離，除艾氏劑、七氯外，其他農殘的方法檢測限、回收率和靈敏度均滿足痕量農殘分析技術要求。實驗表明，艾氏劑和七氯用C小柱的回收率比HLB小柱富集的回收率高，其他農殘的回收率均不及HLB 小柱，綜合其他農殘的回收率選擇了HLB小柱，這可能是其回收率偏低的原因。該法相比于傳統的液液萃取，能有效富集水中的有機物，克服了傳統液液萃取中試劑用量大、污染環境、回收率不高等缺點，同時節約了人工，能完全實現樣品預處理的自動化操作。