基于網絡藥理學探討黃芩苷治療轉移性乳腺癌的作用機制

王振龍 ，韓育英 ，張秀麗 ，李佳鳳 ，沈阿靈 *，彭 軍 *

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州 350122；2.福建中醫藥大學老年病重點實驗室，福建 福州 350122；3.閩江師范高等專科學校，福建 福州 350122；4.福建省婦幼保健院，福建福州350001）

乳腺癌是最常見的惡性腫瘤之一，2020年全球新發病例數高達226 萬，病死率占所有惡性腫瘤的6.9%，嚴重威脅人類健康［1］。研究表明乳腺癌致死的最主要原因就是發生耐藥及遠處轉移［2］，可見，防治轉移性乳腺癌對提高患者預后和延長生存期有著重要意義，進一步尋找能夠有效抑制乳腺癌轉移的藥物迫在眉睫。

中醫藥因其具有多成分、多靶點和整體調節的特點，可通過多靶點、多通路產生治療效果，在臨床腫瘤治療中發揮越來越重要的作用，特別是從天然植物中尋找低毒性、高抗癌活性的化合物單體備受青睞［3］。黃芩苷是一種從傳統中藥黃芩中分離得到的活性黃酮類化合物，在抗腫瘤等方面有著諸多積極作用，對乳腺癌亦有抑制作用［4-7］，而對于轉移性乳腺癌的調控機制仍缺乏系統層面的研究。因此，本研究擬通過網絡藥理學的方法研究黃芩苷、作用靶點和轉移性乳腺癌之間的關系，探討黃芩苷治療轉移性乳腺癌的潛在靶點及作用機制。

1 方 法

1.1 黃芩苷的成藥性檢驗 以“Baicalin”作為檢索詞在中藥系統藥理學平臺（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）［8］獲得黃芩苷的藥代動力學（AD?ME）等數據，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug likeness，DL）≥0.18 作為黃芩苷的成藥性檢驗依據［9］，獲取黃芩苷化合物的MOL2 文件，用于后續黃芩苷的作用靶點預測。

1.2 黃芩苷的作用靶點預測 將“1.1”獲取的黃芩苷的 MOL2 文件導入到Pharmmapper 數據庫（http：//lilab.ecust.edu.cn/Pharmmapper/）［10］，選擇最大生成的構象（maximum generated conformations）為“1 000”，選擇目標（select targets set）設定為人類蛋白質，獲取黃芩苷的潛在作用靶點。然后，將獲得的潛在作用靶 點導 入 Uniplot 數據 庫（https：//www.uniprot.org/）［11］轉化成統一的基因名，設置基因來源為人源性，從而獲得黃芩苷的作用靶點。

1.3 黃芩苷治療轉移性乳腺癌的作用靶點的獲取 以“Metastatic breast cancer”為檢索詞在Gene?Cards 數據庫（https：//www.genecards.org/）［12］檢索相關疾病靶點，以相關性得分（relevance score）≥中位數作為篩選條件獲得轉移性乳腺癌的的疾病靶點。利用 Venny 2.1.0 的在線工具（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）與黃芩苷的作用靶點相映射，得到黃芩苷與轉移性乳腺癌共同靶點，即是黃芩苷治療轉移性乳腺癌的作用靶點。

1.4 共同靶點相互作用網絡（PPI 網絡）構建與分析 將黃芩苷與轉移性乳腺癌共同靶點輸入STRING 數據庫（https：//cn.string-db.org/）［13］“multi?ple proteins”檢索欄中，物種設置為“homo sapiens”，選擇置信度＞0.7，其余的參數保持為默認設置，以獲取相互作用關系信息表。將PPI 網絡數據導出為“tsv”格式文件，然后將文件導入Cytoscape 軟件建立PPI 網絡，同時對網絡進行拓撲結構分析，以“Degree”“Closeness Centrality”和“Betweenness Cen?trality”3 個指標均大于中位數作為篩選條件，獲取具有拓撲重要性的靶點，定義為黃芩苷治療轉移性乳腺癌的核心靶點［14］。

1.5 GO 和KEGG 富集分析 將共同靶點導入DA?VID 數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）［15］進行 GO 和KEGG 富集分析。以P＜0.01、錯誤發生率（FDR）＜0.01 作為篩選依據，獲取黃芩苷治療轉移性乳腺癌的信號通路及生物學過程。并且依據富集基因數從多到少進行排序，篩選出KEGG 富集分析結果中排名前10 的信號通路及GO 富集分析結果中排名前10 的生物學過程。

2 結 果

2.1 黃芩苷的成藥性檢驗 利用TCMSP 數據庫獲得了黃芩苷（PubChem CID：64982）的藥代動力學（ADME）數據，如：黃芩苷的分子量（MW）＝446.39 da、口服生物利用度（OB）＝40.12%、類藥性（DL）＝0.75 等，由黃芩苷 MW＜500 da、DL＞0.18、OB＞30%表明黃芩苷與已知藥物相似，具有成藥性。

2.2 黃芩苷的作用靶點 利用Pharmmapper 數據庫導入黃芩苷（Molecule ID：MOL002776）的MOL2文件獲取412 個黃芩苷的潛在作用靶點，使用Uniplot 數據庫轉化成統一的基因名，去除重復項，獲得399 個黃芩苷的作用靶點。

2.3 黃芩苷治療轉移性乳腺癌的作用靶點 在GeneCards 數據庫共收集獲得了轉移性乳腺癌的6 377 個相關疾病靶點，經篩選獲得3 188 個疾病靶點。將黃芩苷的作用靶點和轉移性乳腺癌的疾病靶點分別輸入Venny 2.1.0 在線工具分析，得到共同靶點（即是黃芩苷治療轉移性乳腺癌的作用靶點）206 個，并用 Cytoscape 軟件作圖，見圖 1。

圖1 黃芩苷治療轉移性乳腺癌的作用靶點

2.4 PPI 網絡分析結果 將黃芩苷與轉移性乳腺癌共同靶點導入String 數據庫中，獲得一個206 個節點、1 063 條邊的 PPI 網絡圖，見圖 2。PPI 網絡分析得到：“Degree”中位數為 9、“Closeness Centrality”中位數為 0.373 966 942 148 76 和“Betweenness Cen?trality”中位數為 0.002 112 449 542 506 35，經篩選獲得具有拓撲重要性靶點（即黃芩苷治療轉移性乳腺癌的核心靶點）62 個，包含絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、磷脂酰肌醇3-激酶（PIK3R1）、靶向調控熱休克蛋白90α 編碼基因（HSP90AA1）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶（SRC）、GTP 酶（HRAS）、表皮生長因子受體（EGFR）、促生長因子（IGF1）、雌激素受體α（ESR1）、酪氨酸蛋白激酶（JAK2）、B 細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）等，見圖3。

圖2 共同作用靶點互作（PPI）網絡圖

圖3 黃芩苷治療轉移性乳腺癌的核心靶點網絡圖

2.5 GO 富集分析 運用DAVID 數據庫對黃芩苷治療轉移性乳腺癌相關的206 個靶點進行GO 富集分析（P＜0.01），獲取209 個基因本體條目，其中生物過程（BP）相關條目134 個，主要涉及信號轉導、凋亡過程的負調控、炎癥反應、蛋白磷酸化、細胞增殖、細胞遷移、MAPK 級聯、血管生成等方面；分子功能（MF）的相關條目51 個，主要涉及蛋白質結合、蛋白激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、類固醇激素受體活性、ATP 結合等方面；細胞成分（CC）的相關條目24 個，主要涉及細胞質、細胞外間隙、胞外外泌體等方面。并根據富集基因數由多到少進行排序，篩選出排名前10 名，使用GraphPad prism 制圖軟件制作可視化柱狀圖，見圖4。

圖4 共同靶點的GO 富集分析圖

2.6 KEGG 通路分析 運用DAVID 數據庫對黃芩苷治療轉移性乳腺癌相關的206 個靶點進行KEGG通路分析（P＜0.01），獲得具有顯著性的信號通路88 條，并且依據富集基因數從多到少進行排序，排名前10 名的信號通路，見表1。由表1 可知：這些共同靶點主要富集在癌癥的途徑、PI3K/Akt 信號通路、Ras 信號通路、癌癥中的蛋白多糖、Rap1 信號通路、FoxO 信號通路、MAPK 信號通路等信號通路。

3 討 論

本研究結果顯示：黃芩苷可能通過調控癌癥的途徑、PI3K/Akt 信號通路、Ras 信號通路、癌癥中的蛋白多糖、Rap1 信號通路、FoxO 信號通路、MAPK信號通路等發揮對轉移性乳腺癌的治療作用，其中多條均被證實參與乳腺癌的疾病進展［16-17］。拓撲重要性靶點及信號通路主要通過信號轉導、蛋白磷酸化、蛋白水解、基因表達、炎癥反應及細胞凋亡、增殖、遷移等過程實現對轉移性乳腺癌的調控。

PI3K/Akt 信號通路是惡性腫瘤最常見的異常調控通路之一，其功能失調性活化與乳腺癌臨床預后不良密切相關［16-17］。PI3K 是生長因子受體超家族信號轉導過程中的重要組成部分，激活后的PI3K 可引起下游蛋白磷酸化，促進細胞發生間充質轉化和細胞外基質沉積［18］。有研究表明：PI3K/Akt 信號通路磷酸化可促進乳腺癌細胞的遷移和侵襲［19］，并主要與 Src、PI3K、Akt 蛋白的磷酸化水平密切相關［20］。Akt 亦屬 PI3K 的下游直接靶蛋白，參與調控細胞增殖及代謝，促進纖維化相關基因轉錄和蛋白質合成［21］，可調節下游包括凋亡、細胞周期、細胞增殖等多種生物過程［22］。AKT1 與 HSP90AA1作用密切相關，而HSP90AA1 可影響乳腺癌的生存期長短［23］。血漿的HSP90AA1 可抑制腫瘤細胞增值和轉移［24］，在乳腺癌組織中比正常組織的表達明顯增高，可用于預測乳腺癌的發生和遠處轉移風險［25］。另外，Akt 還可通過上皮間質轉化（EMT）相關蛋白來促進乳腺癌的侵襲和轉移［26］，下調E-鈣黏蛋白及上調N-鈣黏蛋白，使其獲得了不同的間質細胞形態，表現出廣泛的細胞骨架重構，可能觸發多種細胞因子、生長因子，使細胞的游走能力大大提高，并增強了與周邊間質組織的親和能力，腫瘤細胞進而得以擴散以及轉移。因此，本研究預測黃芩苷可作用于這些相互作用密切的靶點PI3K、AKT1、HSP90AA1、SRC，調控信號轉導、蛋白磷酸化、細胞增殖、細胞遷移等生物過程，進而抑制乳腺癌細胞的轉移。

絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路參與細胞的增殖、分化、凋亡等細胞生理活動，該通路的關鍵因子有 Ras、Raf、MEK 和 ERK 蛋白，與多種人類腫瘤的發生、發展密切相關。目前公認的機制是一旦Ras-MAPK/ERK 信號通路活化異常，可導致自身突變激活，被上游信號持續激活，進而激活下游的蛋白，造成血管形成、細胞增殖、凋亡抑制等，最終造成腫瘤的產生與進展。MAPK 信號通路的上游是 Ras/Raf 蛋白，下游包括 p38、c-Jun N 端激酶（JNK）與細胞外信號調節激酶（ERK）等，而在乳腺癌細胞內可檢測到ERK 的活性異常增高［27］。ERK屬于MAPK 亞家族成員，ERK 信號通路可下調抗凋亡蛋白B 細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2），上調促凋亡因子、Bax 及p38，進而誘導細胞凋亡，起到抑制癌癥的作用［7］。另外，MAPK-mTOR 信號通路中通過調節mTOR、細胞外信號調節激酶ERK1/2 及p38等的表達，促進微管相關蛋白LC3（LC3-Ⅱ）和自噬基因-1（Beclin-1）的表達，可抑制腫瘤細胞的增殖，從而發揮抗腫瘤作用［28］。因此，本研究結果預示黃芩苷可能通過調控MAPK、Bcl-2 等核心作用靶點的表達調控腫瘤細胞的增殖、凋亡，發揮治療轉移性乳腺癌的作用。

目前，轉移性乳腺癌病死率高且易復發，特別棘手的一種是三陰性乳腺癌，具體為雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）及人表皮生長因子受體2（HER2）陰性。其中，HER2 是 EGFR 成員之一，研究表明EGFR 具有重要的信號轉導作用，可調控PI3K/Akt 信號通路影響乳腺癌細胞的黏附與遷移［29］。EMT 是癌癥侵襲和轉移進展的關鍵步驟［30］，TGF-β1 能夠誘導 EMT，增強體外乳腺癌細胞侵襲轉移能力［31］，TGF-β 誘導的 EMT 又可被抑制活化的p38 促分裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）所阻斷。有趣的是，本研究結果顯示黃芩苷治療轉移性乳腺癌可能涉及的癌癥的途徑、MAPK 通路、癌癥中的蛋白多糖、FoxO 信號通路均有EGFR、TGF-β 的參與。由此可見，EGFR 與 Akt、MAPK、TGF-β 等靶點之間復雜交互作用，共同調控EMT，進而影響乳腺癌的侵襲和轉移。

綜上所述，本研究結果表明：黃芩苷可能基于PI3K/Akt 信號通路、Ras 信號通路、MAPK 信號通路等核心信號通路，以及調控HSP90AA1、PIK3R1、Akt、SRC、MAPK、EGFR 和 TGF-β 等重要靶點之間復雜交互作用，從而發揮治療轉移性乳腺癌的作用，具體的分子機制還需進一步探討或通過實驗研究來進一步驗證。