姜黃素對高糖誘導的人視網膜血管內皮細胞增殖及VEGF和NF-κB p65表達的抑制作用

項 彪，潘穎喆，謝安琪，程 希，鄧 玲

0引言

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最常見的慢性微血管并發癥之一。DR導致視力下降甚至失明最主要的階段是增殖性糖尿病視網膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)。流行病學調查表明，DR診斷25a后，PDR的患病率接近50%，且大多數1型糖尿病(T1DM)患者將在大約10a后發展為PDR[1]，其病理學特征主要為晚期組織缺血缺氧，誘導多種促血管生成因子和炎癥因子的釋放增加，導致新生血管的形成，從而繼發玻璃體積血和視網膜脫離引起患者視力喪失[2]。在DR的發生發展進程中，VEGF和NF-κB起著非常關鍵的作用。其中，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)被認為是促進血管生成的最主要因子，也是抗血管生成的重要靶點[3]。研究發現，PDR患者玻璃體和纖維血管組織中的VEGF水平顯著高于正常眼[4]。核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)是一種多向性核轉錄因子，廣泛參與機體的免疫、炎癥等生理病理過程[5]。研究發現，DR高血糖狀態可引起活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成增加，從而介導大量的炎癥因子釋放，而炎癥因子和ROS水平上調又可進一步激活NF-κB，導致視網膜低度炎癥[6]。姜黃素(curcumin，Cur)是一種從姜科植物姜黃中提取的主要的多酚類活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種藥理作用，尤其在抗腫瘤方面具有較強的功效，能通過下調VEGF的表達抑制腫瘤新生血管的形成[7-8]。研究還發現，姜黃素顯著降低脂質過氧化，增加細胞內抗氧化劑含量，調節抗氧化酶，并清除高血糖誘導的ROS產生[9]。但其對于高糖誘導的人視網膜血管內皮細胞(human retinal capillary endothelial cells，HRCECs)是否也能通過降低VEGF、NF-κB的表達而發揮治療作用尚不明確。因此，本研究通過CCK-8細胞增殖實驗、Western-blot及免疫細胞化學法，探討姜黃素對于高糖誘導的HRCECs作用的潛在機制。

1材料和方法

1.1材料HRCECs(上海中科院細胞庫)；低糖/高糖DMEM培養基(美國Gibco公司)；姜黃素、胰酶(美國Sigma公司)；CCK-8細胞增殖試劑盒(上海碧云天生物公司)；兔抗人VEGF多克隆抗體，兔抗人NF-κB多克隆抗體，兔抗人血管內皮生長因子IgG，蛋白預染Marker，BCA蛋白濃度測定試劑盒(武漢博士德生物公司)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)；全自動酶標儀(美國Bio-Rad公司)。本研究經襄陽市第一人民醫院醫學倫理委員會審核通過。

1.2方法

1.2.1姜黃素溶液的配置姜黃素，純度>95%，稱取14.2mg姜黃素粉末溶解于1mL 100%的二甲基亞砜(DMSO)溶劑中，根據C=m/M.V，配制成濃度為40mmol/L的姜黃素母液，除菌分裝后保存在-20℃冰箱中。臨用前，用DMEM高糖培養基稀釋至實驗所需濃度，DMSO終濃度<0.1%。

1.2.2細胞處理及分組將HRCECs置于含有青/鏈雙抗、胎牛血清的DMEM培養基中，放入培養箱中培養。取處于對數生長期的細胞進行實驗分組：空白組(G0組，只含高糖DMEM培養基的調零組)，正常對照組(NG組，低糖DMEM培養基+細胞)，高糖對照組(HG組，高糖DMEM培養基+細胞)，G1組(高糖DMEM培養基+細胞+20μmol/L姜黃素)，G2組(高糖DMEM培養基+細胞+40μmol/L姜黃素)，G3組(高糖DMEM培養基+細胞+80μmol/L姜黃素)。正常糖濃度的DMEM培養基葡萄糖濃度為5.5mmol/L，統稱為低糖培養基；高糖DMEM培養基中葡萄糖濃度為25mmol/L；G0組僅設于CCK-8實驗。

1.2.3CCK-8法檢測HRCECs增殖取對數生長期且長勢良好的HRCECs用于實驗，將細胞經PBS洗滌、胰酶消化、離心后，用DMEM培養基制成濃度為5×104cell/mL的單細胞懸液，以每孔200μL將懸液接種于96孔板內，每組設5個復孔，培養至細胞貼壁。按照上述分組分別培養12、24、48h，向每孔加入CCK-8溶液10μL，37℃孵育4h后，用酶標儀在450nm波長下測定各孔吸光度值(A值)，計算每組濃度復孔平均值及細胞增殖抑制率，上述實驗重復3次。細胞抑制率(%)=[(對照組平均A值-加藥組平均A值)/(對照組平均A值-空白組平均A值)]×100%。

1.2.4Western-blot法檢測HRCECs中蛋白的表達收集各組處理24h后的HRCECs用PBS洗滌，加入適量的RIPA裂解液4℃下反應20min以提取細胞總蛋白。加入1/5體積的5×蛋白上樣緩沖液，置于100℃沸水中10min。BCA法檢測蛋白濃度。按照每孔50μg上樣量進行SDS-PAGE電泳。恒流300mA電轉90min后，用5%的脫脂牛奶室溫下封閉60min。然后分別加入經TBST液稀釋的VEGF、NF-κB和β-actin一抗4℃孵育過夜，洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的二抗室溫下孵育1h。采用Image J軟件測定灰度值，計算A值，以β-actin為內參計算蛋白相對表達量。

1.2.5免疫細胞化學法檢測HRCECs中蛋白的表達將預先消毒滅菌的蓋玻片放入6孔板內，制備濃度為5.0×104cell/mL的單細胞懸液，每孔內滴入2mL懸液，培養48h后棄液，按照分組加入不同的條件培養液，共5組：NG組、HG組、G1～G3組，每組設2個復孔，繼續培養24h后取出蓋玻片，用PBS洗滌、4%多聚甲醛室溫固定15min。再經PBS洗滌，0.1%Triton-X100室溫通透化處理15min作染色前處理。然后在3%過氧化氫-甲醇溶液中浸泡30min，以滅活內源性過氧化物酶，用PBS液洗滌后，再將其置于二抗來源的非免疫兔血清濕盒中封閉30min，去除血清后甩干；加入一抗(兔抗人VEGF 1∶200)，同時用PBS代替一抗設為陰性對照組，4℃濕盒中過夜，室溫下復溫30min，PBS液洗滌，加入生物素標記的二抗37℃孵育1h。最后，經SABC法染色、DAB顯色、蘇木素復染、乙醇梯度脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，干燥后顯微鏡下觀察。上述實驗重復3次。計算各組標本灰度值：陽性灰度值與背景灰度值之差。

2結果

2.1CCK-8法檢測姜黃素對高糖誘導的HRCECs增殖能力的影響干預不同時間各組A450比較，差異有統計學意義(F組間=687.00，F時間=179.50，F交互=26.74，均P<0.001)。與NG組相比，HG組中HRCECs增殖能力顯著增強(P<0.01)，隨著干預時間的延長而增強。增殖抑制率隨著藥物的濃度增加而上升，具有濃度依賴性。在相同藥物濃度作用下，隨著干預時間的延長，細胞增殖能力減弱(P<0.01)，細胞增殖抑制率逐漸上升，具有時間依賴性。結果表明，高糖環境下的HRCECs增殖能力顯著增強，而姜黃素對高糖誘導的HRCECs增殖有明顯抑制作用，且隨著濃度的增加、干預時間的延長抑制作用增強，見表1，圖1。

表1 不同濃度姜黃素作用不同時間后對高糖誘導的HRCECs增殖的影響

圖1 不同濃度姜黃素作用不同時間后對高糖誘導的HRCECs增殖抑制率的影響。

2.2Western-blot法檢測姜黃素對高糖誘導的HRCECs中VEGF-A和NF-κBp65表達的影響實驗結果顯示：與NG組比較，HG組中VEGF-A、NF-κB p65的表達顯著升高(P<0.01)；與HG組比較，G1～G3組中VEGF-A、NF-κB p65的表達均顯著下降(P<0.01)；在相同藥物濃度作用下，隨著干預時間延長，HRCECs中VEGF-A、NF-κB p65的表達呈下降趨勢(P<0.01)；在相同干預時間下，HG組與G1～G3組之間兩兩比較，隨著姜黃素濃度增加，HRCECs中VEGF-A、NF-κB p65的表達呈下降趨勢(P<0.01)。結果表明，姜黃素對高糖誘導的HRCECs中VEGF-A、NF-κB p65的表達具有下調作用，且在藥物濃度范圍內呈劑量-時間依賴性，見表2、3，圖2～4。

表2 高糖誘導的HRCECs經不同濃度姜黃素干預12、24、48h后VEGF-A的表達

圖2 姜黃素作用12h后對高糖誘導的HRCECs中VEGF-A和NF-κB p65表達的影響。

圖3 姜黃素作用24h后對高糖誘導的HRCECs中VEGF-A和NF-κB p65表達的影響。

圖4 姜黃素作用48h后對高糖誘導的HRCECs中VEGF-A和NF-κB p65表達的影響。

2.3免疫細胞化學法檢測姜黃素對高糖誘導的HRCECs中VEGF表達的影響VEGF的表達主要存在于HRCECs的細胞膜及細胞漿中，陽性表現為棕褐色顆粒著染。灰度值結果示，與NG組比較，HG組HRCECs中VEGF的表達明顯增多(P<0.01)。不同濃度姜黃素干預24h后與HG組比較，HRCECs中VEGF表達明顯減少(P<0.01)，隨著藥物濃度增加，細胞膜及細胞漿中的棕褐色陽性著染逐漸減少，顏色變淡，不同濃度加藥組之間兩兩比較，差異均有統計學意義(P<0.01)。表明姜黃素能有效抑制HRCECs中VEGF的表達，且隨著藥物濃度增加抑制作用增強，上述結果與Western-blot結果相符，見表4、圖5。

圖5 免疫細胞化學法檢測姜黃素對高糖誘導的HRCECs中VEGF表達的影響。

3討論

視網膜新生血管(retinal neovascularization ,RNV)是DR患者病情惡化、視力喪失的主要原因，其發生發展與HRCECs的增殖、VEGF及NF-κB表達上調之間關系密切。

表3 高糖誘導的HRCECs經不同濃度姜黃素干預12、24、48h后NF-κB p65的表達

表4 姜黃素作用24h后各組HRCECs中VEGF的表達

新生血管的形成過程十分復雜，主要包括血管基底膜降解、內皮細胞增殖、遷移、成管四個階段。研究發現，長期高糖環境對不同組織的血管內皮細胞影響不同，對大血管內皮細胞主要表現為抑制其生長，而對微血管內皮細胞反而表現為促進其增殖[10]。本實驗結果也提示，高糖環境下，HRCECs的增殖能力顯著增強，與既往文獻報道相符[11]；在給予不用濃度姜黃素干預后，可明顯降低HRCECs的增殖能力，且抑制作用隨著藥物濃度增加、干預時間延長而增強。表明高糖誘導的HRCECs增殖能力增強，而姜黃素對其可有效抑制。

參與調控RNV形成的細胞因子眾多，血管生成因子(如VEGF)起刺激作用，血管抑素和色素上皮衍生因子(PEDF)起抑制作用[12]。正常環境下，各種因子保持動態平衡。但在高血糖、氧化應激及非感染性炎癥反應等病理狀態時，平衡狀態會被破壞，促使血管生成的主要因子VEGF表達上調[13]。VEGF與其受體結合后，可激活下游的PI3K/Akt、p38及Raf等通路，來調控內皮細胞的增殖。本實驗中Western-blot和免疫細胞化學法結果均顯示，HG組細胞中VEGF的表達量較NG組顯著增加，表明一定濃度范圍內高糖環境可上調VEGF的表達，與既往文獻報道相符[11]。姜黃素在抗新生血管形成方面的作用已經得到了證實。研究發現，姜黃素能通過調控VEGF信號通路誘導氧化應激和抑制血管生成，在結直腸癌的治療上發揮作用[8]。李勇等[7]研究發現，姜黃素可通過降低VEGF的表達水平，抑制肝癌組織缺氧誘導的血管形成和肝癌細胞生長轉移。本實驗采用不同濃度姜黃素處理高糖誘導的HRCECs后發現，加藥組細胞VEGF的表達顯著下降，且呈濃度與時間依賴性。結合CCK-8結果，表明姜黃素抑制體外高糖誘導的HRCECs增殖可能與VEGF表達下調有關。

NF-κB是一種關鍵的促炎轉錄因子，其信號通路的激活是DR炎癥反應發生發展過程中的關鍵一步。在PDR患者中，高血糖介導的ROS生成增加、NF-κB激活與VEGF上調之間關系顯著[14]。研究發現，高糖環境下氧化應激誘導的ROS上調和非酶糖基化產物與其受體的結合，均能引起NF-κB的持續激活[6,15]。正常情況下，NF-κB在胞漿中與抑制蛋白(I-κB)結合處于失活狀態。當受到刺激時，I-κB激酶發生磷酸化，導致游離的NF-κB易位到細胞核，與特定的基因序列結合，誘導多種促炎因子、黏附因子、炎性酶、趨化因子等表達，從而促進炎癥發生、細胞增殖和血管生成[5]，表明NF-κB的激活是始動事件，隨后其他炎癥通路的激活逐步導致了DR微血管損傷。研究還發現NF-κB通路的激活能誘導VEGF的表達[16]。姜黃素對NF-κB通路的抑制作用已在多種細胞中被報道。研究發現，姜黃素能通過抑制I-κB激酶和NF-κB活性誘導慢性粒細胞白血病細胞的KCL-22細胞凋亡[17]，其機制可能是由姜黃素自身的抗炎、抗氧化等藥理特性改變了細胞的微環境和對ROS水平的調控。本研究中Western-blot結果示HG組細胞中NF-κB p65的表達量較NG組顯著增加，表明NF-κB通路在DR進展過程發揮著重要作用，與既往文獻報道相符[11]。在給予不用濃度姜黃素干預后，加藥組細胞NF-κB p65的表達顯著下降，且呈濃度與時間依賴性。結合CCK-8結果，表明姜黃素抑制體外高糖誘導的HRCECs增殖可能與NF-κB p65表達下調有關。

綜上所述，本實驗證實姜黃素能抑制高糖誘導的HRCECs增殖，其機制可能與其下調HRCECs中VEGF-A、NF-κB p65的表達有關。但本實驗僅是體外實驗，而且關于RNV的生成因素只考慮了VEGF和NF-κB，實際上DR的發病機制復雜，參與的細胞因子眾多，是多種因素相互作用的結果。本實驗尚未明確姜黃素抑制VEGF、NF-κB表達的具體機制，及它們間的相互作用關系。姜黃素對高糖誘導的HRCECs增殖及VEGF、NF-κB p65表達的抑制作用的具體機制等問題有待進一步實驗進行深入研究。