復方芩蘭口服液的體內外成分分析和網絡藥理學研究

許雅婧，樂心逸，葛一蒙，沈龍海，吳 彤，李默影, 3*

復方芩蘭口服液的體內外成分分析和網絡藥理學研究

許雅婧1，樂心逸1，葛一蒙2，沈龍海1，吳 彤1，李默影1, 3*

1.上海醫藥工業研究院 創新藥物與制藥工藝國家重點實驗室，上海 200437 2.黑龍江珍寶島藥業股份有限公司，黑龍江 虎林 158400 3.江南大學糧食發酵與食品生物制造國家工程研究中心，江蘇 無錫 214122

采用液質聯用技術對復方芩蘭口服液的主要化學成分及其進入血液和組織中的成分進行鑒定，并選擇主要的體內成分開展網絡藥理學研究，初步揭示其作用機制。采用UPLC-Q-TOF-MS結合MSE技術進行復方芩蘭口服液、血液和組織樣本分析，結合精確相對分子質量、保留時間、碎片離子、中性丟失等信息進行復方芩蘭口服液的化學成分和體內成分鑒定。利用Cytoscape軟件分別構建復方芩蘭口服液主要體內成分與其功能主治（感冒、發熱、咳嗽、咽痛）之間的“化合物-靶點”作用網絡，開展核心靶點和作用通路分析，并采用實時熒光定量PCR對核心靶點中的3個熱休克蛋白（HSP90AA1、HSP90AB1、HSPA8）進行生物學驗證。大鼠ig給藥后在血液樣本中檢測到3個原型成分和9個代謝產物，組織樣本中檢測到3個原型成分和5個代謝產物，代謝產物主要為葡萄糖醛酸結合物。網絡藥理學研究結果提示復方芩蘭口服液的作用通路主要與炎癥和免疫相關，且生物學驗證結果表明上呼吸道感染大鼠肺臟組織中HSP90AA1、HSP90AB1、HSPA8的mRNA表達在給予復方芩蘭口服液后顯著上調（＜0.01）。利用UPLC-Q-TOF-MS分析復方芩蘭口服液的體內外成分并進行網絡藥理學研究，初步明確了復方芩蘭口服液的作用靶點和通路，并選擇3個關鍵靶點進行生物學驗證。研究結果為進一步揭示其藥效物質基礎和作用機制提供科學依據。

復方芩蘭口服液；UPLC-Q-TOF-MS；體內成分；網絡藥理學；“化合物-靶點”作用網絡

中藥復方是中醫藥臨床應用的主要形式，集中體現了“辨證論治，輔以補中”的治療原則。由于復方的多成分、多靶點和協同效應，為其作用機制的科學闡述帶來了較大困難。網絡藥理學作為近年來研究中藥復方作用機制的新興學科，使用多種分析工具從大量數據庫中提取成分和靶點相關信息，通過建立復方中目標成分對于相關疾病的調控網絡，從而揭示復方的作用機制。復方芩蘭口服液由金銀花、黃芩、連翹、板藍根4味藥材制成，辛涼解表，清熱解毒，用于外感風熱引起的發熱、咳嗽、咽痛[1-2]。雖然前期分析表明復方芩蘭口服液成分較為復雜，但只有經消化道直接吸收入血或者經消化道分解成為代謝產物吸收入血，到達靶器官或靶點才能發揮相應的藥效。因此本研究首先采用UPLC-Q-TOF-MS對復方芩蘭口服液進入正常大鼠的血液和器官組織（肝、心、脾、肺、腎）中的成分進行鑒定，以明確其潛在活性成分，再以此作為目標成分分別構建相對于感冒、發熱、咳嗽和咽痛的“化合物-靶點”作用網絡，篩選出核心靶點進行通路分析及生物學驗證，初步揭示復方芩蘭口服液的作用機制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters AcquityTM超高效液相色譜系統（美國Waters公司），配置二元泵，自動進樣器和PDA檢測器；Waters Xevo G2單四級桿飛行時間質譜儀配置電噴霧電離源（美國Waters公司）；Merck Milli-Q超純水機（美國Millipore公司）；MS105DU型半微量天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；H1850R型臺式高速冷凍離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；XH-D型旋渦混合器（上海汗諾儀器有限公司）；DC-12氮吹儀（上海安譜科學儀器有限公司）；SK250HP型超聲波清洗器（250 W、53 kHz，上海科導超聲儀器有限公司）；T 10 basic ULTRA- TURRAX組織勻漿器（德國IKA集團）；ABI Stepone plus型熒光定量PCR儀（美國Thermo公司）。

1.2 樣品與試劑

復方芩蘭口服液（批號B14200301）由黑龍江珍寶島藥業股份有限公司提供。孟魯司特鈉咀嚼片（魯南貝特制藥有限公司，批號16201201）購自上海復美大藥房；大前門香煙購自上海煙草集團有限責任公司；脂多糖（LPS）試劑（批號13F-4020）購自Sigma公司；辣椒素（批號93CHRUYK）購自安耐吉化學。對照品蔗糖（批號111507-201704）、綠原酸（批號110753-201716）、連翹苷（批號110821-201615）購自中國食品藥品檢定研究院；黃芩苷（批號4245）、漢黃芩苷（批號5744）、連翹酯苷E（批號6982）、黃芩素（批號3634）、毛蕊花糖苷（批號3632）購自上海詩丹德生物技術有限公司；新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C均為實驗室自制，所有對照品質量分數均大于98.0%。

RNA提取液（Servicebio，G3013）、熒光定量試劑盒（Roche，04913914001）、反轉錄試劑盒（Thermo，#K1622）購自武漢塞維爾生物科技有限公司；乙腈（LC-MS級）、甲酸（LC-MS級）均購自賽默飛世爾科技公司；水為超純水；其他試劑均為分析純。

1.3 實驗動物

雄性SD大鼠（SPF級，體質量180～200 g）購自上海斯萊克實驗動物責任有限公司，生產許可證號：SCXK（滬）2012-2002，使用許可證號：SYXK（滬）2009-0068），飼養于上海醫藥工業研究院藥理評價研究中心。實驗前均適應性喂養7 d [濕度（50±10）%；溫度（25±2）℃；12 h晝夜循環]，可自由獲取食物和飲用水。動物實驗由上海醫藥工業研究院藥理評價研究中心實驗動物倫理委員會審查并批準（批件號FW2020-290）。

2 方法

2.1 體內外成分分析

2.1.1 供試品溶液的制備 精密吸取復方芩蘭口服液2 mL，加水稀釋并定容至10 mL量瓶中，濾過，取續濾液，即得。

2.1.2 對照品溶液的制備 取13種對照品適量，分別加入水或甲醇使溶解，分別配制成質量濃度為0.1 mg/mL的對照品溶液。

2.1.3 動物試驗分組、給藥及樣本處理 12只大鼠隨機分為對照組和復方芩蘭口服液組，實驗前12 h禁食不禁水。按31.5 mL/kg（5倍人用臨床劑量折算）ig 給藥，對照組給予等體積的生理鹽水。給藥2 h分別于眼底靜脈叢取血后將動物處死，迅速取出心、肝、脾、肺、腎。血漿于4000 r/min離心10 min，取上清液；組織樣本用生理鹽水沖洗表面，吸干水分，加入3倍量冰生理鹽水，用組織勻漿器勻漿，得組織勻漿液；樣本均于?80 ℃冰箱保存。

分別精密移取大鼠血清和各組織勻漿液500 μL，加入1 mol/L鹽酸50 μL，渦旋60 s，再精密加入1.5 mL甲醇-乙腈（1∶1）的混合液，渦旋60 s，12 000 r/min于4 ℃離心15 min，取上清液氮氣吹干，殘渣加入100 μL甲醇復溶，渦旋60 s，12 000 r/min于4 ℃離心10 min，取上清液，備用。

2.1.4 液質聯用條件

（1）色譜條件：Waters ACQUITY T3 C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：0.1%甲酸水（A）-0.1%甲酸乙腈（B）；柱溫為35 ℃；體積流量0.3 mL/min；進樣量：5 μL；梯度洗脫：0～3 min，100% A；3～8 min，100%→95% A；8～12 min，95%→85% A；12～18 min，85%→75% A；18～25 min，75%→50% A；25～27 min，50%→20% A；27～28 min，20%→100% A；28～30 min，100% A。

（2）質譜條件：Xevo G2-XS Q-TOF-MS系統，ESI電離源，正、負離子模式。MS參數設置：質量掃描范圍為50～1500；干燥氣（N2）體積流量為500 L/h，溫度400 ℃；電離源溫度120 ℃；錐孔氣體積流量為100 L/h，電壓為40 V；毛細管電壓為3.5 kV。在MSE模式下，低碰撞能為6 eV，高碰撞能為25～60 eV。亮氨酸腦啡肽溶液（0.2 ng/mL）作為外標溶液對質量進行實時校正，體積流量為5 μL/min，在負離子模式下/554.261 5 [M－H]?，正離子模式下/556.277 1 [M＋H]+。

2.1.5 數據采集及分析 采用Masslynx 4.1軟件進行數據采集并提取各主要質譜峰的信息，根據對照品比對或參考MassBank（http://www.massbank.jp/）數據庫中檢索得到的質譜圖，結合保留時間、準分子離子峰、碎片離子、中性丟失等綜合分析，進行復方芩蘭口服液的化學成分鑒定。對給藥組和對照組樣本進行對比分析，提取兩組間差異性質譜峰的信息，依據原型成分的裂解碎片及可能的代謝途徑，結合保留時間、精確相對分子質量和碎片離子等信息，進行復方芩蘭口服液的體內成分鑒定。

2.2 網絡藥理學研究

2.2.1 靶點預測 以復方芩蘭口服液體內成分相關化合物黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素、連翹酸、連翹酯苷E、綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C作為目標成分，利用中藥系統藥理數據庫和分析平臺（TCMSP，http://ibts.hkbu.edu.hk/）、Swiss （http://www.swisstargetprediction.ch/）、STITCH（http://stitch.embl.de/）檢索相關靶點。以感冒、發熱、咳嗽、咽痛作為復方芩蘭口服液的主要適應癥，應用TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）和OMIM（https://omim.org/）檢索相關靶點。分別去除各數據庫重復靶點后在Uniprot（https://www.uniprot.org/）中逐一查詢各靶點所對應的基因名稱并匯總。

2.2.2 蛋白-蛋白相互作用（protein protein interaction，PPI）網絡構建 將檢索結果按照格式要求整理后導入Cytoscape 3.8.0軟件，利用Bisogenet插件分別構建各目標成分相關靶點和各適應癥相關靶點的PPI圖。由于該插件由多個蛋白質相互作用關系數據庫構成，可以在已知靶點的基礎上進行廣泛的拓展。PPI網絡中的節點（node）代表潛在靶點，邊（edge）則代表靶點間的相互作用。

2.2.3 核心靶點篩選及網絡構建 分別對各目標成分PPI與各適應癥PPI取交集，采用CytoNCA插件計算交集靶點的節點連接度（degree）并以其中位數的2倍為卡值[3]，從中篩選出核心靶點，分別構建復方芩蘭口服液各適應癥的“化合物-靶點”作用網絡。

2.2.4 通路富集 利用DAVID（https://david- d.ncifcrf.gov/home.jsp）分別對復方芩蘭口服液作用于各適應證的主要靶點進行通路富集分析。

2.3 生物學驗證

通過網絡藥理學分析，選擇與復方芩蘭口服液4種適應證均密切相關的HSP系列蛋白（HSP90AA1、HSP90AB1、HSPA8），采用實時熒光定量PCR進行靶點驗證。

2.3.1 動物分組、造模及給藥 30只大鼠隨機分組，其中對照組、模型組各7只，復方芩蘭口服液組、陽性藥組各8只。除對照組外，其余3組大鼠均置于煙熏室進行煙熏造模，每次10只進行煙熏20 min，每日2次，連續10 d。分別于第1、3、7、10天采用LPS誘導上呼吸道感染，方法為大鼠每次滴鼻吸入1 mg/mL LPS溶液，每只大鼠0.2 mL。之后于第11～14天采用辣椒素霧化對大鼠進行呼吸道刺激，5 min/d。

造模后各組大鼠均正常飼養1周，于第8天開始，復方芩蘭口服液組和陽性藥組分別按照6 mL/kg和0.5 mg/kg（按照臨床人用劑量折算）ig給予復方芩蘭口服液和孟魯司特鈉，1次/d，連續7 d；同時對照組和模型組每日給予相同體積的生理鹽水。給藥結束次日將所有大鼠以7%水合氯醛麻醉并處死，取大鼠肺部組織樣本，處理同“2.1.3”項，于?80 ℃保存。

2.3.2 PCR檢測 引物設計交由武漢塞維爾生物科技有限公司完成，以GADPH（5′-CTGGAGAAA- CCTGCCAAGTATG-3′，5′-GGTGGAAGAATGGGAG TTGCT-3′）作為內參基因，目的序列分別為：HSP90AA1（5′-GCAAGACCGAACCCTCACTATT-3′，5′-CCATTGGTTCACCTGTGTCT-3′）；HSP90AB1（5′-TCAACTTCATCCGTGGTGTGG-3′，5′-GACTG- AGAGGTATGGTAGCGAAG-3′）；HSPA8（5′-AGG- ATTTGCTGCTCTTGGATGT-3′；5′-AAGCAGGTTG- TTGTCCTTGGTC-3′）。

取?80 ℃凍存的大鼠肺臟，每100毫克加入1 mL Trizol提取RNA，反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR檢測。PCR擴增條件為95 ℃、10 min 1個循環；95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，40個循環，PCR儀采集熒光信號，熔解曲線為從60 ℃升至95 ℃時，每15秒升溫0.3 ℃。以GAPDH為內參基因，通過2???Ct方法對內參基因t值與待檢基因t值進行計算，得出樣本間表達量差異倍數關系。

3 結果

3.1 體內外成分鑒定結果

3.1.1 化學成分鑒定結果 復方芩蘭口服液在正、負離子模式下的總離子流圖如圖1所示。共鑒定出32個主要化合物，包括9個有機酸類（奎寧酸、檸檬酸、咖啡酸、綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C）、5個環烯醚萜類（去乙酰車葉草苷酸、五福花苷酸、山梔子苷B、梔子新苷、斷氧化馬錢苷）、6個黃酮類（山柰酚-3--蕓香糖苷、黃芩苷、千層紙素-7--β--葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素）、2個苯乙醇苷類（3,4-二羥基苯乙醇苷、連翹酯苷E）、2個環己醇苷類（連翹環己醇苷B、連翹酸-1′--β-葡萄糖苷）、2個苯丙素類（毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷）、1個木脂素類（連翹苷）和5個其他類（精氨酸、蔗糖、氧化脯氨酸、腺苷、鳥苷）。具體見表1。

3.1.2 入血成分鑒定 對照組和給藥組大鼠血清在正、負離子模式下的總離子流圖見圖2，共鑒定12個入血成分（表2），包括3個原型成分：連翹酯苷E（M2）、黃芩苷（M8）、漢黃芩苷（M11）和9個代謝產物。推測連翹酸-1′--β-葡萄糖苷在大鼠體內經過I相反應中的水解代謝成為苷元連翹酸（M1）。咖啡酰奎寧酸類化合物（綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C）經I相反應中的水解代謝成為咖啡酸，再經過II相反應中的葡糖醛酸化形成咖啡酸葡萄糖醛酸結合物。結合參考文獻中的保留時間，鑒定M3和M4分別為咖啡酸-4--β--葡萄糖醛酸和咖啡酸- 3--β--葡萄糖醛酸[4]。黃芩苷經I相反應中的水解形成黃芩素，其5-OH、6-OH和7-OH為代謝活性位點，再經II相反應中的葡糖醛酸化形成單葡萄糖醛酸和雙葡萄糖醛酸代謝產物。結合參考文獻，鑒定黃芩素-5,7-二葡萄糖醛酸苷（M5）、黃芩素-5,6-二葡萄糖醛酸苷（M6）、黃芩素-6,7-二葡萄糖醛酸苷（M7）、黃芩素-5--β--葡萄糖醛酸苷（M9）和黃芩素-6--β--葡萄糖醛酸苷（M12）5個代謝產物[5]。漢黃芩苷與黃芩苷代謝途徑類似，結合參考文獻，鑒定其代謝產物漢黃芩素-5--β--葡萄糖醛酸苷（M10）[5]。黃芩素和漢黃芩素也可以直接發生相應的葡萄糖醛酸化反應。

圖1 復方芩蘭口服液在正離子模式(A) 和負離子模式(B)下的總離子流圖

表1 復方芩蘭口服液中鑒定的化學成分

Table 1 Identification of the chemical constituents in Fufang Qinlan Oral Liquid

峰號tR/min分子式準分子離子m/z誤差(×10?6)碎片離子鑒定結果實測值理論值 10.87C6H14N4O2[M＋H]+175.120 1 175.119 53.43158 [M＋H－OH]+精氨酸 21.28C12H22O11[M－H]?341.108 6341.108 40.59387 [M＋COOH]–蔗糖* 31.92C6H8O7[M－H]?191.018 9191.019 2?1.57173 [M－H－H2O]–, 111 [M－COOH－2H2O]–檸檬酸 42.15C5H7NO3[M＋H]+130.050 1 130.050 4?2.3884 [M－COOH]+氧化脯氨酸 56.41C7H12O6[M－H]?191.055 4191.055 6?1.0585 [M－H－CO－2H2O－C2H2O]–奎寧酸 67.52C14H20O8[M－H]?315.107 6315.108 0?1.27361 [M＋COOH]–, 135 [M－H－Glc－H2O]–3,4-二羥基苯乙醇苷 77.92C10H13N5O4[M＋H]+268.103 9268.104 6?2.61136 [M＋H－Rib]+腺苷 87.95C10H13N5O5[M＋H]+284.099 7 284.099 40.74152 [M＋H－Rib]+鳥苷 98.24C14H24O8[M＋COOH]?365.144 6365.144 8?0.47319 [M－H]?, 161 [M－C8H15O3]?連翹環己醇苷B 108.74C14H24O9[M－H]?335.134 3335.134 20.30155 [M－H－Glc－H2O]?連翹酸-1′-O-β-D-葡萄糖苷 119.82C16H22O11[M－H]?389.108 5389.108 40.26227 [M－H－Glc]?, 191 [M－H－Glc－2H2O]–去乙酰車葉草苷酸 1210.93C16H24O10[M－H]?375.129 2375.129 10.21213 [M－H－Glc]?, 151 [M－H－Glc－H2O－COO]–五福花苷酸 1311.13C16H18O9[M－H]?353.087 5353.087 30.57191 [M－H－C9H6O3]–新綠原酸* 1411.73C20H30O12[M－H]?461.166 3461.165 90.87315 [M－H－Rha]–, 205 [M－H－C6H6O2－Rha]–, 163 [M－H－C8H8O2－Glc]–, 135 [M－H－Glc－Rha－H2O]–連翹酯苷E* 1512.59C16H18O9[M－H]?353.086 4353.087 3?2.55191 [M－H－C9H6O3]–綠原酸* 1612.79C16H22O10[M－H]?373.113 7373.113 50.62193 [M－H－Glc－H2O]–梔子新苷 1712.89C16H18O9[M－H]?353.087 7353.087 31.27173 [M－H－C9H6O3－H2O]–隱綠原酸* 1813.23C9H8O4[M－H]?179.033 4179.034 4?5.59135 [M－H－COO]–咖啡酸 1913.73C17H24O11[M－H]?403.122 9403.124 0?2.73241 [M－H－Glc]–斷氧化馬錢子苷 2014.61C17H24O11[M－H]?403.124 0403.124 00223 [M－H－Glc－H2O]–山梔子苷B 2115.76C29H36O15[M－H]?623.198 2623.197 60.98477 [M－H－Rha]–, 461 [M－H－C9H6O3]–, 443 [M－H－C9H6O3－H2O]–異毛蕊花糖苷 2216.23C29H36O15[M－H]?623.198 2623.197 60.98477 [M－H－Rha]–, 461 [M－H－C9H6O3]–, 443 [M－H－C9H6O3－H2O]–毛蕊花糖苷* 2316.60C27H30O15[M－H]?593.151 3593.150 61.11447 [M－H－Rha]–, 285 [M－H－Rha－Glc]–山柰酚-3-O-蕓香糖苷 2417.36C25H24O12[M－H]?515.119 5515.119 01.07353 [M－H－C9H6O3]–, 173 [M－H－2C9H6O3－H2O]–異綠原酸B* 2517.95C25H24O13[M－H]?515.119 5515.119 01.07353 [M－H－C9H6O3]–, 173 [M－H－2C9H6O3－H2O]–異綠原酸A* 2618.49C25H24O14[M－H]?515.119 5515.119 01.07353 [M－H－C9H6O3]–, 173 [M－H－2C9H6O3－H2O]–異綠原酸C* 2719.75C21H18O11[M－H]?445.077 4445.077 10.72269 [M－H－GluA]–黃芩苷* 2820.35C27H34O11[M＋COOH]?579.208 2579.207 80.76371 [M－H－Glc]–連翹苷* 2920.63C27H34O12[M＋COOH]?579.209 7579.207 83.35371 [M－H－Glc]–, 356 [M－H－Glc－CH3]–千層紙素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷 3021.07C22H20O11[M－H]?459.093 1459.092 70.81283 [M－H－GluA]–, 268 [M－H－GluA－CH3]–漢黃芩苷* 3123.36C15H10O5[M－H]?269.045 1269.045 00.41251 [M－H－H2O]–黃芩素* 3224.96C16H12O5[M－H]?283.059 5283.060 6?3.89268 [M－H－CH3]–漢黃芩素

*由對照品確定；Glc-葡萄糖取代基 Rib-核糖取代基 Rha-鼠李糖取代基 GluA-葡萄糖醛酸取代基

*The identification was confirmed with standards; Glc-glucoside Rib-ribosyl Rha-rhamnoside GluA-glucuronic acid

A-空白血清正離子模式 B-含藥血清正離子模式 C-空白血清負離子模式 D-含藥血清負離子模式

表2 復方芩蘭口服液在大鼠體內的入血成分鑒定結果

Table 2 Analysis of absorbed components of Fufang Qinlan Oral Liquid in rat plasma

峰號tR/min分子式準分子離子m/z誤差(×10?6)碎片離子鑒定結果實測值理論值 M1 7.04C8H14O4[M－H]?173.080 1173.081 4?7.51 連翹酸 M211.37C20H30O12[M－H]?461.164 5461.165 9?3.04443, 163, 135連翹酯苷E M311.98C15H16O10[M－H]?355.067 5355.066 52.81179咖啡酸-4-O-β-D-葡萄糖醛酸 M412.65C15H16O10[M－H]?355.067 5355.066 52.81179咖啡酸-3-O-β-D-葡萄糖醛酸 M515.25C27H26O17[M－H]?621.109 0621.109 2?0.32445, 269黃芩素-5,7-二葡萄糖醛酸苷 M617.47C27H26O17[M－H]?621.109 0621.109 2?0.32445, 269黃芩素-5,6-二葡萄糖醛酸苷 M717.65C27H26O17[M－H]?621.109 0621.109 2?0.32445, 269黃芩素-6,7-二葡萄糖醛酸苷 M819.09C21H18O11[M－H]?445.078 4445.077 12.92269, 891黃芩苷 M919.68C21H18O11[M－H]?445.074 1445.077 1?6.74269黃芩素-5-O-β-D-葡萄糖醛酸苷 M1020.19C22H20O11[M＋H]+461.108 3461.108 4?0.22285漢黃芩素-5-O-β-D-葡萄糖醛酸苷 M1120.86C22H20O11[M＋H]+461.108 3461.108 4?0.22285漢黃芩苷 M1220.94C21H18O11[M－H]?445.078 4445.077 12.92269, 891黃芩素-6-O-β-D-葡萄糖醛酸苷

3.1.3 組織分布成分鑒定 對照組和給藥組大鼠各組織樣本在正、負離子模式下的總離子流圖見圖3，共鑒定3個原型成分和3個代謝產物（表3）。發現肝臟、肺臟、腎臟是復方芩蘭口服液的主要作用器官，其中的代謝成分主要經I相代謝反應中的水解和II相代謝反應中的葡萄糖醛酸化形成。通過對復方芩蘭口服液的化學成分和體內成分進行分析，發現其中的多種咖啡酰奎寧酸類成分，黃芩苷、漢黃芩苷及其相應的苷元、連翹酯苷E和連翹酸-1′-- β-葡萄糖苷是其進入大鼠血液和組織的主要成分，可能是復方芩蘭口服液的潛在活性成分。

A-空白組織正離子模式 B-含藥組織正離子模式 C-空白組織負離子模式 D-含藥組織負離子模式

表3 復方芩蘭口服液于大鼠各器官組織中吸收成分鑒定結果

Table 3 Analysis of absorbed components of Fufang Qinlan Oral Liquid in rat organ tissue

峰號tR/min分子式準分子離子m/z誤差(×10?6)碎片離子鑒定結果分布器官實測值理論值 M′111.37C20H30O12[M－H]?461.166 2461.165 90.65315, 205連翹脂苷E心、肺 M′212.35C16H18O9[M－H]?353.084 7353.087 3?7.37191, 179綠原酸肺 M′317.16C27H26O17[M－H]?621.109 0621.109 2?0.32445, 269黃芩素-5,6-二葡萄糖醛酸苷肝、腎 M′417.42C27H26O17[M－H]?621.109 0621.109 2?0.32445, 269黃芩素-6,7-二葡萄糖醛酸苷肝、腎 M′519.45C28H28O17[M－H]?635.122 1635.124 8?4.25459漢黃芩素-5,7-二葡萄糖醛酸苷肝、腎 M′620.92C22H20O11[M＋H]+459.093 5459.092 71.74445, 268漢黃芩苷心、肺、腎

3.2 網絡藥理學研究

3.2.1 “化合物-靶點”網絡構建 以檢索得到的已知靶點為基礎分別構建各目標成分和各適應證的PPI網絡，結果見表4。由于綠原酸和新綠原酸，異綠原酸B和異綠原酸C分別為對映異構體，檢索結果和所構建的網絡均相同。連翹酸-1′--β-葡萄糖苷在數據庫中無法檢索到相關靶點，因此選擇其在體內代謝得到的苷元進行靶點檢索。

分別對各目標成分PPI與各適應證PPI取交集，以degree值中位數的2倍為卡值得到的單一化合物與適應證之間的核心靶點。由于核心靶點仍然數量眾多，所構建的網絡過于復雜，進行通路分析缺乏針對性。因此選擇degree值排名前10%的靶點分別構建復方芩蘭口服液各適應證的“化合物-靶點”作用網絡。具體見圖4。外圈藍色靶點僅與少數化合物相關（≤3），而內圈黃色靶點均受到多個目標成分調控（＞3），為復方芩蘭口服液的關鍵作用靶點。

表4 各PPI網絡所得靶點及相互作用數量

Table 4 Number of targets and interactions of each PPI network

PPI網絡靶點數量靶點間相互作用數量PPI網絡靶點數量靶點間相互作用數量 黃芩苷176527 112隱綠原酸297935 094 黃芩素6386136 250異綠原酸A372553 688 漢黃芩苷7567473異綠原酸B（異綠原酸C）333642 575 漢黃芩素6942147 508咳嗽114818 440 連翹酸119917 259發熱314369 304 連翹酯苷E7606546感冒279664 997 綠原酸（新綠原酸）309239 169咽痛200637 058

A-感冒 B-發熱 C-咳嗽 D-咽痛，代表化合物 代表靶點

3.2.2 通路富集及分析 對復方芩蘭口服液調控感冒、發熱、咳嗽、咽痛的關鍵靶點分別進行通路富集，并對4種適應證均相關的作用通路進行總結，結果見表5。提示復方芩蘭口服液的作用通路主要與炎癥和免疫密切相關[6-10]。

3.2.3 生物學驗證 各組大鼠肺臟中3個HSP系列蛋白的表達水平見表6。結果表明模型大鼠肺臟中HSPA8和HSP90AB1的mRNA表達水平較正常大鼠顯著上升（＜0.05），HSP90AA1也有一定的上升趨勢，提示了大鼠肺部出現了炎癥反應，咳嗽和炎癥的復合模型造模成功。給予復方芩蘭口服液后，以上3個指標均出現了極顯著上調（＜0.01），且程度均優于臨床常用止咳藥孟魯司特鈉咀嚼片。說明HSP系列蛋白可能是復方芩蘭口服液發揮消炎止咳作用的關鍵靶點。

表5 復方芩蘭口服液主要作用靶點和通路

Table 5 Primary targets and pathways of Fufang Qinlan Oral Liquid

主要作用通路主要作用靶點 estrogen signaling pathwayHSPA8, HSP90AA1, HSP90AB1, ESR1, EGFR, AKT1, GRB2 prostate cancerHSP90AA1, HSP90AB1, EP300, CDK2, MDM2, AKT1, GRB2, IKBKG, EGFR PI3K-Akt signaling pathwayHSP90AA1, HSP90AB1, CDK2, MDM2, AKT1, GRB2, IKBKG, YWHAZ, EGFR, FN1, BRCA1 pathways in cancerNTRK1, HSP90AA1, HSP90AB1, HDAC1, EGFR, CASP3, TRAF6, CDK2, MDM2, AKT1, EP300, GRB2, IKBKG cell cycleHDAC1, CDK2, MDM2, CUL1, EP300, YWHAZ, MCM2 NOD-like receptor signaling pathwayHSP90AA1, HSP90AB1, TRAF6, IKBKG

表6 各組大鼠肺臟中HSPA8、HSP90AA1和HSP90AB1的mRNA表達水平

Table 6 mRNA Expression of HSPA8, HSP90AA1 and HSP90AB1 levels in rats lung of each group

組別相對表達量 HSPA8HSP90AA1HSP90AB1 對照1.11±0.261.49±0.451.04±0.41 模型1.19±0.18#1.58±0.411.13±0.38# 復方芩蘭口服液1.50±0.35**2.20±0.50***1.34±0.25*** 陽性對照1.43±0.53*1.61±0.631.13±0.38*

與對照組比較：#＜0.05；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01***＜0.001

#< 0.05control group；P < 0.05**< 0.01***< 0.001model group

4 討論

本實驗采用液質聯用對復方芩蘭口服液的體內外成分進行研究。取樣時間點上考察了0.5、1、2、4、6 h多個時間點，發現給藥后2 h在大鼠的血清和組織樣本中可檢測到的移行成分最多，故將其作為最佳的采樣時間點。樣本處理方法比較了甲醇沉淀蛋白、乙腈沉淀蛋白及沉淀蛋白后采用醋酸乙酯進行萃取等處理方式，結果均不理想，最終采用本實驗的處理方法。樣本分析所采用的UPLC-Q- TOF-MS結合MSE技術能夠通過一次數據采集獲得高精確度和高分辨率的全部母離子與碎片離子信息，從而較為全面、真實、快速的定性大鼠血液和組織樣本中的移行成分。

給藥后在大鼠的血清中共鑒定3個原型成分和9個代謝產物，組織樣本中共鑒定3個原型成分和3個代謝產物。通過與單味藥材圖譜進行對比，其中咖啡酸葡萄糖醛酸由多種咖啡酰奎寧酸類成分代謝得到，和綠原酸一起主要來自金銀花。連翹酸和連翹酯苷E來自連翹。黃芩苷、漢黃芩苷及其苷元的多種葡萄糖醛酸產物來自黃芩。多項藥理研究表明這些成分具有廣泛的抗炎、抗菌、抗氧化和免疫調節等藥理作用[11-18]，可能是復方芩蘭口服液辛涼解表、清熱解毒的潛在活性成分。

網絡藥理學研究結果表明復方芩蘭口服液可以通過多通路多靶點發揮療效，通過富集分析發現主要的作用通路多包含HSP系列蛋白。在熱休克蛋白家族中，HSP90具有特殊的分子伴侶功能。其廣泛參與了眾多細胞增殖和調亡的信號調控，在炎癥反應中起著重要作用。HSP90可以和受體相互作用蛋白激酶（receptor-interacting protein kinase，RIP）相互作用并使其穩定。RIP在腫瘤壞死因子α的刺激下結合到腫瘤壞死因子受體上，從而激活核轉錄因子[19]。因此推測HSPA8、HSP90AA1和HSP90AB1可能是復方芩蘭口服液發揮抗炎作用的重要靶點，并且在大鼠咳嗽和炎癥的復合模型中得到證實。

本研究首次對復方芩蘭口服液的體內外成分進行分析，并在明確潛在活性成分的基礎上首次構建了相關適應證的“化合物-靶點”作用網絡，初步揭示其主要作用靶點及通路。研究結果為揭示復方芩蘭口服液的藥效物質基礎和作用機制提供了一定基礎。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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andcomponent analysis and network pharmacology study of Fufang Qinlan Oral Liquid

XU Ya-jing1, YUE Xin-yi1, GE Yi-meng2, SHEN Long-hai1, WU Tong1, LI Mo-ying1, 3

1.State Key Laboratory of New Drug and Pharmaceutical Process, Shanghai Institute of PharmaceuticalIndustry, Shanghai 200437, China 2.Heilongjiang Zhenbaodao Pharmaceutical Co., Ltd., Hulin 158400, China 3.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Chiina

Liquid mass spectrometry was used to identify the chemical constituents of Fufang Qinlan Oral Liquid (復方芩蘭口服液) and its metabolites in rat.The maincomponents were selected for network pharmacological and the mechanism was initially revealed.Fufang Qinlan Oral Liquid, serum and tissue samples were analyzed by UPLC-Q-TOF-MS combined with MSEtechnique, and the identification ofandcomponents were carried out with the information of precise molecular weight, retention time, fragment ions and neutral loss.Cytoscape software was used to construct the “compound-target” network between the maincomponents and the main clinical indications (cold, fever, cough and sore throat).Core targets and pathway analysis were also conducted, in which HSP90AA1, HSP90AB1 and HSPA8 were measured by realtime PCR.Three prototype components and nine metabolites were characterized in rat serum after ig administration, so as three prototype components and five metabolites in rat tissues.The metabolites were mainly glucuronide conjugates.The results of network pharmacology indicated that the pathways of Fufang Qinlan Oral Liquid were mainly related to inflammation and immunity.Compared with model rats, the expression of HSP90AA1, HSP90AB1, and HSPA8 was significantly increased after intragastric administration of Fufang Qinlan Oral Liquid (＜0.01).Thecomponents were preliminarily analyzed after oral administration of Fufang Qinlan Oral Liquid by UPLC-Q-TOF-MS and the network pharmacology study was then carried out, which initially clarified the targets and pathways.The studies provided scientific basis for pharmacodynamic material basis and mechanism of Fufang Qinlan Oral Liquid.

Fufang Qinlan Oral Liquid; UPLC-Q-TOF-MS;metabolite; network pharmacology; “compound-target” network

R284.1

A

0253 - 2670(2022)09 - 2623 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.09.004

2021-11-12

許雅婧，女，碩士研究生，研究方向為生藥學專業。E-mail:1796958002@qq.com

通信作者：李默影，女，博士，從事天然藥物活性成分及作用機制研究。E-mail: wuweisong2009@126.com

[責任編輯 王文倩]